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1、1胃癌组织中 P16，CMYC 和 COX2的表达及其与患者预后的关系作者：翟俊山 李楠 张林 王艳梅 朱超慧 吴凯【摘要 】 目的探讨胃癌组织中 P16，CMYC 和 COX2 表达情况、相互关系及其与患者预后的关系。 方法应用免疫组化SABC 法检测 104 例手术切除胃癌组织中 P16，CMYC 和COX2 的表达。 结果胃癌中 P16，CMYC 和 COX2 表达阳性率分别 39.4%(41/104)，57.7%(60/104)，63.5%(66/104) 。P16 的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM 分期，不同组织学类型均有显著差异(P0.05)；CMYC 的表达
2、在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM 分期有显著差异(P 0.05)，而与不同组织学类型无统计学差别(P0.05) ；COX2的表达在胃癌中与淋巴结有无转移，TNM 分期，不同组织学类型均有显著差异(P0.05) ，而与不同的浸润深度无统计学差别(P0.05) 。而它们与肿瘤患者年龄，性别均无统计学差异(P0.05)。等级相关分析结果显示 P16 与 CMYC、COX2 表达呈负相关 (P0.05)，CMYC 与 COX2 表达呈正相关(P0.05)。生存曲线研究结果显示 P16，CMYC 和 COX2 表达与患者术后生存时间显著相关(P 0.05)。 结论P16 在胃癌组织中低表
3、达及 CMYC 和COX2 高表达能客观反映胃癌组织分化程度，侵袭转移能力，且其2与患者预后密切相关。故检测三种指标可正确判断胃癌患者预后，在指导临床治疗方面有一定价值。 【关键词】 P16；CMYC ；COX2 ；胃癌；预后；基因表达Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of P16， CMYC and COX2 in gastric carcinoma and relationship with the pathogenesis，infiltration ，metastasis，prognosis of the patients.
4、Method The expressions of P16，CMYC and COX2 were detected by inununohistochemical methods in 104 surgical resection specimens.ResultThe positive expression rates of P16，CMYC and COX2 were 39.4%(41/104),57.7%(60/104),63.5%(66/104).The expression of P16 was notably correlated with the depth of invasio
5、n， lymph nodes metastasis，pathologic type，TNM stage in gastric carcinoma (P0.05)；the expression of CMYC was notably correlated with the depth of invasion， lymph nodes metastasis，TNM stage in gastric carcinoma (P0.05),but not related to the pathologic type(P0.05) ；the expression of COX2 was notably c
6、orrelated with lymph nodes metastasis，pathologic 3type，TNM stage in gastric carcinoma (P0.05),but not related to the depth of invasion(P0.05)；they all were not related to the age and sex (P0.05).The expression of P16 was negatively correlated with CMYC and COX2 protein (P 0.05).The expression of CMY
7、C protein was positively associated with that of COX2. Also，the expressions of P16，CMYC and COX2 were obviously correlated with the survival time of postoperative patients (P0.05).Conclusion The lower expression of P16 and higher expression of CMYC and COX2 reflected prognosis of patient with gastri
8、c carcinoma; combining detection of P16，CMYC and COX2 may be helpful for predicting the prognosis of the patients with GC，which is significant in clinical application.Key words：P16；CMYC ；COX2 ；gastric carcinoma；prognosis；gene expression本文用免疫组化 SABC 法联合检测抑癌基因 P16，癌基因CMYC 和 COX2 在手术切除胃癌细胞中的表达水平，探讨P16，
9、CMYC 和 COX2 表达产物与胃癌的浸润深度，淋巴结转移，TNM 分期、病理分型及与患者预后的关系。41 材料与方法1.1 材料 收集解放军总医院第二附属医院从 1999 年至2004 年，104 例术后病理证实为胃恶性肿瘤的存档组织蜡块。男77 例，女 27 例，年龄 2680 岁，平均 57.7 岁。所有病例术前均未予非甾体类药、抗生素、化疗和放疗等治疗。1.2 试剂 兔抗人环氧化物酶 2（COX2 ）单克隆抗体、鼠抗人 p16 单克隆抗体及 p16 阳性对照片、COX2 阳性对照片购于北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人 Cmyc 单克隆抗体与Cmyc 阳性对照片购于福州迈新生物技术
10、开发有限公司，SABC（兔 IgG）POD 试剂盒（SA1022) 与 DAB 显色试剂盒(蓝)(AR1025)：购自武汉博士德生物工程有限公司。1.3 方法1.3.1 免疫组化 SABC 操作方法 按试剂盒说明书操作，所有一抗经预试验后以 1： 100 稀释，用 PBS 代替一抗作空白对照，以正常鼠血清替代一抗做阴性对照，所购阳性组织切片同样染色作阳性对照。按阳性染色细胞的百分率10%记为()，10% 记为(+)。观察 P16，CMYC 和 COX2 的表达，及三者与不同的浸润5深度，淋巴结有无转移，TNM 分期，不同组织学类型间的差异。1.3.2 随访 所有病例经电话或门诊等随访，随访时间
11、最长为5 年。5 年后仍存活的患者，其生存时间视为 5 年。1.3.3 统计学处理 所有数据用 CHISS 统计软件包进行分析，计数资料用 x2 检验，相关分析采用 Spearman 等级相关，KaplanMeier 法作生存率曲线，生存率比较用 logrank 检验，预后分析采用 COX 多因素回归分析，P0.05 视为差异有统计学意义。2 结果2.1 胃癌中 P16，CMYC 和 COX2 的表达 p16 蛋白和Cmyc 蛋白表达阳性均为胃癌细胞核与细胞浆棕黄着色,其阳性率分别为 39.4%(41/104)、57.7%(60/104)；COX2 蛋白表达阳性为胃癌细胞浆和细胞膜棕黄着色，其
12、阳性率为 63.5%(66/104)。2.2 胃癌中 P16，CMYC 和 COX2 表达的相关性与临床病理（表 1） P16 的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM 分期，不同组织学类型均有显著差异(P0.05)；CMYC 的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM 分期有显著差异(P0.05) ，而与不同组织学类型无统计学差6别(P 0.05)；COX2 的表达在胃癌中与淋巴结有无转移，TNM 分期，不同组织学类型均有显著差异(P0.05)，而与不同的浸润深度无统计学差别(P0.05) 。而它们与肿瘤患者年龄，性别均无统计学差异(P0.05)。Spearman
13、等级相关分析结果显示 P16 与CMYC、 COX2 表达呈负相关(P0.05)，CMYC 与 COX2 表达呈正相关(P0.05) 。2.3 KaplanMeier 生存分析 单因素分析胃癌组织中P16，CMYC 和 COX2 表达对预后的影响，分别将P16，CMYC 和 COX2 表达分阳性组和阴性组，制出KaplanMeier 生存曲线，进行 Logrank 时序检验。单因素分析结果显示 P16 高表达组生存时间为(34.5424.42)月，显著高于低表达组(26.9422.34)月(P0.05) ；而 CMYC 和 COX2 高表达组 5 年生存率分别为(24.3319.46) 月、(
14、23.8320.01) 月显著低于低表达组(35.7725.20)月、(35.9725.37)月(P0.05)。2.4 Cox 多因素回归分析 Cox 多因素分析表明P16、CMYC 和 COX2 的表达，浸润深度、 TNM 分期、和淋巴结转移是影响患者生存时间的重要因素，而年龄、性别及组织学类型对生存时间无明显影响。其中 P16 阳性表达的风险比为 0.60(95%可信区间为 0.3660.995，P0.05)；其中 CMYC 阳性表达的风险比为 1.75(95%可信区间为 1.1002.794 ，P0.05)；其中7COX2 阳性表达的风险比为 1.92(95%可信区间为1.1763.13
15、2，P0.05)。3 讨论p16 蛋白是一种周期蛋白依赖性激酶抑制因子，它通过阻止细胞由 G1 期进入 S 期，直接抑制细胞增殖。当 P16 基因发生突变、缺失时，p16 蛋白不能正常表达，使细胞增殖失控，发生癌变2 。通过本实验提示 P16 基因缺失或异常表达是胃癌发生过程中一个早期事件，决定了肿瘤细胞的侵袭能力，与上皮内发生的癌变能否突破各层组织有直接关系。根据随访术后患者生存期资料，P16 也是也是影响患者预后的一个重要指标，是一个重要的胃癌抑制基因。Cmyc 蛋白可促进细胞增殖, 永生化、去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位3 。本组实验提示在胃黏膜的癌变过程中 CMYC
16、基因可能被激活，CMYC 基因参与了胃癌的发生及发展。CMYC 高表达的患者肿瘤恶性程度高，转移能力强，表明在胃癌的发生及发展过程中，Cmyc 蛋白的主要作用是促进细胞增殖与去分化，凋亡作用不明显。虽然胃癌的病理组织类型与CMYC 无明显关系（P0.05） ，但多因素分析表明胃癌的组织类型并不是影响预后的一个重要指标（P0.05） 。8环氧化酶(cyclooxygenase,COX) 又称前列腺素内过氧化物合成酶(PGHS)，是前列腺素(PGs) 合成过程中一个主要的限速酶。本研究提示 COX2 蛋白的高表达是一个晚期事件，不影响肿瘤细胞的侵袭能力，但与转移能力密切相关。高表达 COX2 的患者
