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1、1胃癌组织 survivin mRNA 的表达及其与预后的关系【摘要 】 目的 探讨生存素（Survivin）mRNA 在胃癌组织中的表达与临床病理及其预后的关系。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）检测 41 例胃癌患者与 9 例良性胃疾病患者手术标本中的 Survivin mRNA 表达并随访 3 年，将其表达及表达强度与临床病理特征进行相关分析。结果 胃癌组织中 Surviving mRNA 的阳性率（70.7%）均高于癌旁正常组织（17.1%）和良性胃疾病患者组织 Survivin mRNA 表达的阳性率（1/9） （P0.005）癌旁正常组织与良性胃疾病组织 Survivin
2、 mRNA 表达的阳性率差异无显著性（P0.05） ；Survivin mRNA 在胃癌组织的表达及表达强度与年龄、性别、病理分型、分期、解剖部位及淋巴结和（或）远处转移均无明显关系（P0.05） ，但与预后有明显关系（P=0.001 8） 。结论 胃癌组织检测 Survivin mRNA 表达可以作为胃癌诊断的特异性分子标志物之一，且可独立作为预测肿瘤的预后。 【关键词】 胃肿瘤；生存素；mRNA ；预后Expression of Survivin m RNA in Gastric Carcinoma Tissue and Its Relationship with Prognosis2Ch
3、en Hongshen, Yin Jiajun(Department of General Surgy, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian Universily, Dalian 116001, China)Abstract： Objective To assess the value of the detection of survivin m RAN in gastric carcinoma tissues. Methods Carcinomatou and para-carcinomatous normal tissues of 41 pati
4、ents with gastric carcinoma and specimen of nine patients with benign gastric diseases were collected. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) was performed to detect the survivin m RNA expression in the specimens. All the patients were followedup for three years. The results were an
5、alyzed relatively.Results The positive rate of survivin m RNA was higher in the carcinomatous tissues (70.7%) than in the paracarcinomatous normal tissues (17.1%) and the benign gastric diseases tissues (1/9) (P 0.005). There was no signifcant difference between the paracarcinomatous normal tissues
6、and the benign gastric disease tissues (P0.05). Survivin m RAN expression was not related to age, sex, histological subtype, differentiation, 3pathologic grading or lymph node metastases.Conclusion Expression of survivin m RAN in the gastric carcinomatous tissue can be used as a specific molecular m
7、arker for the diagnosis of gastric carcinoma. It can act as an independent prognostic factor.Key words： gastric carcinoma; survivin; m RNA; prognosis分子生物学研究表明，胃癌是一种基因性疾病，癌基因的激活和抑癌基因的失活导致胃癌细胞的增殖异常和凋亡障碍是其发生发展的关键，且基因的异常早于形态学改变。Survivin 表达于人类大多数肿瘤组织中，而在正常成人组织中不表达（除胸腺外） 。Survivin 基因不仅能够抑制凋亡而且在促进细胞增殖、细胞转化
8、中具有重要作用1,2。作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成员之一，Survivin 独特的功能在肿瘤的发生发展中的作用愈来愈受到人们的重视。本研究采用 RTPCR 方法检测胃癌患者手术标本中 Survivin mRNA 的表达，并随访 3 年，将是否表达、表达强度与临床病理特征、预后进行相关分析，以探讨其临床意义。1 资料与方法41.1 一般资料标本取自我院普外 19992002 年 50 例手术患者。41 例经病理组织学确诊为胃癌，其中男 34 例，女 7 例；年龄 3576 岁。留取标本的患者术前均未进行过化疗和放疗。高分化 22
9、 例，中分化 12 例，低分化 7 例；病理期 3 例，期 24 例， 期 7 例，期 7 例；伴有淋巴结转移者 22 例，不伴有转移者 19 例。同时留取癌旁正常组织 41 例。良性胃病 9 例，作为阴性对照，男 8 例，女 1 例；年龄 2663 岁。1.2 主要试剂Trizol（Biobasic 公司，上海生工生物工程技术公司分装） ；逆转录试剂盒（fermentas 公司） ；dNTP，Taq DNA 聚合酶（上海生工生物工程技术公司） ；DL2000 DNA markers（MBI fermentas 公司） ；焦碳酸二乙酯（ DEPC） 、超纯水、琼脂糖、溴化乙绽（EB ） 、溴酚
10、蓝（上海生工公司） ；PBS（经 DEPC 处理） ，电泳缓冲液（TBE） 、氯仿、异丙醇、75%乙醇（经 DEPC 处理） （自备） 。1.3 方法51.3.1 标本的取样与保存胃癌组织取自肿块中央非坏死部分，癌旁正常组织取自远离肿块 5 cm 以上大体形态学正常的胃组织，良性胃疾病组织取自病变最严重部位。组织离体后分成两部分，分别用于做病理组织学和Survivin mRNA 表达测定。用于测定 Survivin mRNA 表达的组织即刻用 DEPC 处理的冷磷酸缓冲液（ PBS）冲洗 3 次，去除血迹。1 h 内放入液氮速冻，在-80冰箱保存。1.3.2 RTPCR 法检测 Survivi
11、n mRNA 表达（1）提取 RNA：取组织 50100 mg 在液氮中速冻，玻璃匀浆器中彻底匀浆。按 Trizol 试剂盒（上海生工生物工程技术公司产品）说明书用一步法提取总 RNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。 （2）逆转录合成 cDNA：取上述提取的 RNA5 l，寡聚脱氧核苷酸 12-18Oligo(dT)12-181 l，加去离子水 6 l，共 12 l 置于 PCR 管中涡旋器上轻微混匀 35 s，以上均冰上操作。70 孵育 5 min 后，冰上冷却，400 r/min 离心 10 s。将 PCR 管置于冰上操作，分别加入：5反应缓冲液 4 l，RNA 酶抑制剂（20 U/l
12、）1 l，10 mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸混合液（dNTP ）2 l，混匀，400 r/min，离心 10 s，收集产物。 37 孵育 5 6min。加 Moloney 小鼠白血病病毒（MMuLV ）逆转录酶（200 U/l）1 l，终体积为 20 l。42 孵育 60 min。70 加热 10 min，冰上冷却后即完成 cDNA 的合成。置-20 保存。 （3）检测Survivin mRNA 表达 Survivin 基因引物设计按参考文献6，由上海生工生物工程技术合成，序列如下：5 GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT 3（Survivin mRNA 第 94113bp
13、） ，5 GCA CTT TCT TCG CAG TTT CC3（Survivin mRNA 第 424443 bp） 。目的基因 338bp。 actin 引物设计按参考文献3 ，由上海生工生物工程技术合成，序列如下：（F）5 CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGC GAC C3， （R）5 CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G 3。目的基因 600bp。检测逆转录效率。在 25 l 反应体系中含有上述合成的 cDNA 1 l，10 mmol/L dNTP 1 l，10 mmol/L MgC12 1.5 l，0.5 mol/L 上下游引物各 0.
14、5 l，Taq DNA 聚合酶 1.25 U（0.25 l） ，5Taq DNA 聚合酶缓冲液 2.5 l，加超纯水至 25 l。进行热循环扩增，反应条件为：9.5 ，变性 1 min； 55 ，退火 1 min，72 ，延伸 1 min，共 31 个循环。1.3.3 病理组织学检查病理组织切片苏木精 伊红（HE ）染色由我院两位病理学专家阅片作出病理诊断。71.4 结果判定PCR 产物用 2%琼脂糖凝胶电泳4（电压按 8V/cm，电流20 mA） ，溴化乙绽（EB）显色，用内参照 actin 检测逆转录效率。紫外线透视下观察结果，可检测到 338 bp 阳性条带（Surviving mRNA
15、）和 600 bp 的条带（actin ） 。DL2000 DNA markers 为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。凝胶成像系统进行摄像并半定量分析。1.5 统计学方法采用方差分析、t 检验、2 检验、秩和检验和四格表确切概率法。2 结果2.1 胃癌组织、癌旁正常组织及良性胃疾病组织手术标本Survivin mRNA 表达情况胃癌手术标本癌组织 Survivin mRNA 表达的阳性率70.7%(29/41)明显高于癌旁正常组织 17.1%（7/41）及良性胃病组织（1/9） （P0.005 和 2=8.59，P0.05） ，详见表 1。表 1 癌旁正常组织、胃癌组织手术标本 Sur
16、vivin mRNA 表达比较（略）2.2 胃癌组织 Survivin mRNA 表达及表达强度与临床病理特征的关系将 Survivin mRNA 表达产物进行半定量（即 Survivin mRNA 条带在凝胶图像的平均密度/actin 条带在凝胶图像的平均密度） ，则可以发现 Survivin mRNA 在胃癌组织表达及表达的强度与年龄、性别、分期、病理分期及是否伴有淋巴结和远处转移均无明显关系（P0.05） ，但与生存期有明显关系（P0.01） ，详见表 2。表 2 患者临床病理特征与胃癌组织 Survivin mRNA 表达及表达强度的比较（略）3 讨论肿瘤的发生存在基因改变的复杂性和多因素
