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1、临床微生物学检验第二章1.细菌大小以微米（m）为测量单位。2.细菌结构：附属结构：鞭毛、菌毛（光镜下看不见，不能作为鉴定依据，没鉴定价值）或纤毛；表层结构：糖萼（荚膜或粘液层）；内部结构：细胞质、质粒、芽孢。3.细菌功能：动力（鞭毛是细菌的运动器官），观察细菌动力可用悬滴法或压滴法在显微镜下直接观察其运动，也可将细菌穿刺接种半固体培养基观察动力。鞭毛具有鉴定价值，采用鞭毛特殊染色（如镀银染色）可观察有无鞭毛及鞭毛数量、分布；一般染色不能看见鞭毛（如革兰氏染色）。4.芽孢的功能：对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等具有强大抵抗力；以是否杀死芽孢作为物品消毒灭菌判断效果的指标。芽孢在菌体的位置和直径大
2、小随菌种不同，这种形态特点有助于细菌鉴别。5.细菌生长曲线（要求整个过程，结合生长曲线记忆 4 个时期比较容易，可能是简答题）细菌二分裂方式进行繁殖。以倾注平板法计数孵育后的菌落数可换算出菌落形成单位（CFU）。生长曲线：连续检测细菌不同培养时间的 CFU，以 CFU 为纵坐标，培养时间为横坐标作出一条反映细菌生长数变化的规律曲线。典型的生长曲线分为迟缓期、对数生长期、稳定期、衰亡期。迟缓期。也称为准备时期，是细菌适应环境的过程。特点：细菌的核酸、蛋白质、辅酶等物质合成增加，细胞体积增大，细菌数量恒定或极少量增加。对数生长期。特点：细菌以最大的速率生长和分裂，细菌数量成对数增加。细菌代谢活跃、
3、稳定，其大小、形态、染色性和生化反应典型，对外界因素反应敏感，是检测细菌生物学性状和进行药物敏感性试验的适宜阶段。不添加培养基下一般细菌对数期维持 48h。稳定期。特点：由于培养基中营养物质消耗、有害代谢产物积累和 PH等环境变化，细菌生长速率降低，细菌死亡数增加使生长繁殖菌数和死亡数处于动态平衡，细菌数量达到最大，即处于稳定期。此时期细菌合成代谢产物较多，通常维持 10h。向培养基系统中补充营养物质，取走代谢产物，改善培养条件，可延长稳定期。由于代谢产物较多，是细菌生化反应试验鉴定的最佳时期。衰亡期。特点：细菌死亡速率逐步增加，活菌数减少，死亡数大于增加数，细菌形态不典型，甚至出现自溶，该时
4、期的细菌不能用于细菌的鉴定和研究工作。6.细菌的生化反应：由于不同细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的分解能力也不一致，因而其代谢产物不同。根据此特点，利用生化试验的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的反应。7. 灭菌：破坏和去除物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）和细菌芽孢的方法。消毒：是破坏物体上活的病原微生物的方法，但不包括细菌芽孢和非病原微生物。防腐：直接使用防腐剂破坏或抑制活病原微生物的方法。无菌：防止感染病原体进入灭菌组织或物品的操作技术称为无菌操作，无菌即不存在活微生物。第四章有感染性的完整病毒颗粒称作病毒体（virion）1.病毒的大小
5、以纳米（nm）测量单位。2.病毒的结构:分为基本结构和辅助结构。基本结构：包括核心（含一种类型核酸即 DNA 或 RNA）和衣壳（蛋白质结构），二者构成核衣壳。辅助结构：包膜（功能：维护病毒体结构的完整性；与宿主细胞膜亲和及融合；决定病毒种、型抗原的特异性）和其他辅助结构（纤维刺突或纤突）。第七章1.细菌标本采集原则：尽早采集。一旦怀疑细菌感染，应及时采集标本进行细菌学检验，对细菌感染的诊断和治疗具有极其重要意义。 选择不同采集时机和标本种类。根据临床症状和流行病学资料可预测感染性疾病的病原体，根据病程和感染部位的不同，选择合适时机采集不同种类标本。在抗生素应用前采集。感染可带来生命危险，临床
6、医生会在细菌学检验出结果之前使用抗生素治疗，抗生素的使用将影响病原菌的检出。因此应尽可能在抗生素使用前留取标本。遵守无菌操作。在采取如脑脊液、血液或穿刺液等正常状态下的无菌部位标本，应严格注意无菌操作，不得被其他部位细菌污染。在有正常菌群寄居的部位，如口咽部、鼻咽部和泌尿生殖道等部位应采取措施避免正常菌群的和其他菌群的污染。盛放标本的容器应无菌。正确保存和运送。采集的标本均含有病原体或潜在的病原体，必须做好标本的正确保存和运送，容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。采集的标本应及时运送，远距离运送时，一般应冷藏（但对脑膜炎和淋病奈瑟菌，需保温 3537）。2.细菌的生理生化特征检测（其
7、中为碳水化合物的代谢试验，为蛋白质和氨基酸的代谢试验，为碳源和氮源利用试验）氧化发酵试验（OF 试验）。又称 Hugh Leifson (HL)试验。必须在有氧环境中才能分解葡萄糖的是专性需氧菌；无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖的是兼性厌氧菌。细菌以分子氧作为电子受体分解葡萄糖的称为氧化型；细菌以无氧降解的方式分解葡萄糖的称为发酵型；不能分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。用于细菌种属间的鉴别。肠杆菌科细菌为发酵型，非发酵菌通常为氧化型或产碱型。微球菌属可氧化葡萄糖，葡萄球菌属能发酵葡萄糖。七叶苷水解试验 用于革兰阴性杆菌（不变色）和肠球菌属（阳性: 黑色）的鉴定
8、甲基红（MR ）试验。原理：细菌在代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细菌可进一步将丙酮酸分解为乳酸、乙酸、甲酸等，使培养基的 pH 下降至 4.5 以下，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，培养基的酸碱度维持在 pH6.2 以上，加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，肠杆菌属、克雷伯菌属等为阴性。VP 试验。原理：细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，有些细菌可将丙酮酸进一步脱酸产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化
9、为二乙酰（丁二酮），进而与培养基中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物（VP 反应阳性）。VP 试验常与与甲基红试验一起使用，两试验的结果阳性、阴性相反。即甲基红试验为阳性的细菌，在 VP 试验中则为阴性（如大肠埃希菌、沙门菌属、志贺菌属）；甲基红试验为阴性的细菌，在 VP 试验中则为阳性（沙雷菌属、阴沟肠杆菌）。吲哚试验。原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，与试剂中的对二甲氨基苯甲酸作用，形成红色的玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。枸橼酸盐利用试验。当细菌利用铵盐作为唯一氮源，利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠，使培养基变碱（阳性）。有助于肠杆菌
10、科细菌的鉴定。氧化酶试验。试验结果未产生颜色反应（如肠杆菌科）为阴性，产生颜色反应（如弧菌科、非发酵菌属，奈瑟菌属）为阳性。过氧化氢酶试验（触酶试验） 链球菌属的触酶，金氏杆菌属细菌阴性卵磷脂酶试验。产生卵磷脂酶的细菌，会在菌落周围形成乳白色混浊环并扩大（阳性）。用于产气荚膜梭菌的鉴定。Optochin 敏感试验。几乎所有的肺炎链球菌都敏感，其他链球菌则耐药。杆菌肽敏感试验。A 群链球菌对杆菌肽几乎 100%敏感，其他群链球菌对杆菌肽通常耐药。凝固酶试验。金黄色葡萄球菌产生凝固酶，使血浆凝固（阳性）。表皮及腐生葡萄球菌的凝固酶则（阴性）。IMViC（I 指吲哚试验，M 指甲基红试验，V 指 V
11、-P 试验，C 指枸橼酸盐试验）试验的两种细菌的试验结果：大肠埃希菌 + + 产气肠杆菌 + +3.病毒大小的测定方法：电子显微镜直接测量；超过滤法；超速离心法。4.分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种；鸡胚接种；组织培养。组织培养为主要的病毒分离培养技术，广泛使用的组织培养技术是细胞培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，分为：原代和次代细胞培养（是正常细胞）二倍体细胞培养（是正常细胞，广泛用于病毒分离和疫苗制备）传代细胞培养（类似肿瘤细胞，常用于病毒的分离和鉴定，不能用于疫苗制备）5.病毒的理化性状的检测：有包膜病毒对乙醚、氯仿、胆盐等脂溶剂均敏感，无包膜病毒对脂溶剂有抵抗。即
12、乙醚敏感试验中有包膜病毒为阳性，无包膜病毒为阴性。耐酸性试验中，不同 pH 值下不同病毒会被很快灭活。如肠道病毒可耐 pH3，鼻病毒在 pH3-5 环境中很快被灭活。6.试比较病毒与细菌的异同处？ 区分细菌的芽孢和真菌的孢子（补充）7.真菌的培养方法：试管培养法（使用方便、不易污染）；大培养法（培养后菌落较大，用于观察菌落，但该法容易污染）；小培养法（又称微量培养法，是观察真菌结构及生长发育的有效方法），其又分为：玻片法、琼脂方块培养法、小型盖片直接培养法。第八章体外抗菌药物的敏感试验纸片扩散法（又称 K-B 法），被 WHO 推荐为 定性 药敏试验的基本方法。原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴
13、在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并且抑菌圈与该药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关。抗菌药物纸片。选择直径 6.35mm，吸水量 20l 专用药敏纸片，20保存备用，每次未用完的药敏纸片放 4保存。内酰胺类抗生素纸片 4保存不宜超过 1 周，否则效价会降低。培养基。CLSI 水解酪蛋白（MH）琼脂为药敏试验的标准培养基，pH 为7.27.4，琼脂厚度 4mm。细菌接种。接种物的准备可采用液体生
14、长法或直接菌落悬液法。用 0.5 麦氏比浊标准管（1.510 8 CFUml）校正菌液浓度，于 15min 内接种完毕。各纸片紧贴在琼脂表面，给纸片中心相距24mm，纸片距平板內缘15mm。 结果解释和报告：接种正确时，细菌生长的平面是连续的而抑菌圈呈均匀的环状。测量抑菌圈直径，参照 CLSI 标准判断结果。分为三级：.敏感（表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀灭），.中介（指测试菌对常规剂量用药后体液或组织中的药物浓度的反应性低于敏感株，但在测定药物浓集部位的体液或高于正常给药量临床上使用有效。），耐药（指测试菌不能被在体内感染部位能达到的抗菌药物浓度所抑制）。（K
15、-B 法试验的）实验影响因素（简答题）A.培养基质量。培养基的成分、pH、深度、硬度和湿度等对结果的准确由直接影响。B.药敏纸片。药敏纸片的含药量是影响抑菌圈大小的重要因素，其次还有药敏纸片的保存方式，低温干燥。C.接种菌量。接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，加大菌量使抑菌圈减小，相反可使抑菌圈扩大。要正确配制，使用和保存麦氏比浊标准管，D.试验操作质量，接种后贴药片的时间，孵育条件和温度、时间，抑菌圈测量工具的精确度和质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异等都是影响纸片法药敏结果的因素。质量控制。采用标准菌株是进行药敏试验质量控制的主要措施。常用的临床药敏质控标准菌株有：金黄色葡萄
16、球菌 ATCC25923，大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单胞菌 ATCC27853、粪肠球菌 ATCC29212 或 33186 等。标准菌株的抑菌圈应在 CLSI 允许的预期范围内，超出控制范围应检查原因并及时纠正。每次药敏试验应将标准菌株和待测菌在同一条件下做药敏试验。稀释法：是 定量 测定抗菌药物抑制细菌生长作用的体外方法，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法（又分为常量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法）。最低抑菌浓度（MIC）：稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度。最低杀菌浓度（MBC）：指能杀灭 99.9以上测试菌量的最低药物浓度。MBC 测试的方法有培养基、药物稀释、细菌悬液接种等，与 MIC 相同，不同之处： 当 MIC 无肉眼可见菌生长管中的菌落数 最初接种菌落数的 0.1，该管的最低药物浓度即为 MB
