《肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt 和缺氧诱导因子 1蛋白表达作者：张铭, 徐振晔, 白冰, 董昀【摘要 】 观察肺岩宁方对人肺腺癌细胞 A549 裸鼠移植瘤中缺氧诱导因子1 （hypoxia inducible factor1，HIF1 ）表达的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号调节的影响。方法：32 只A549 荷瘤裸鼠随机分为 4 组：模型组、顺铂组、肺岩宁方组和综合治疗（顺铂加肺岩宁方）组，每组 8 只。化疗组和综合治疗组于第 1、3、5 天腹腔注射顺铂各 0.1 mg，肺岩宁方组和综合治疗组予肺岩宁方 0.4 ml 灌胃，持续 21 d。观察抑瘤率，逆转录聚合酶链反应
2、（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR ）检测移植瘤中 HIF1 mRNA 表达，免疫组化法检测移植瘤中 HIF1和磷酸化 Akt（phosphorylated Akt, pAkt）蛋白表达。结果：肺岩宁方组裸鼠抑瘤率为 34.17%，综合治疗组为 64.38%。 RTPCR结果显示，综合治疗组 HIF1 mRNA 的表达水平低于模型组（P0.05） 。免疫组化实验显示，化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组移植瘤 HIF1蛋白表达均明显低于模型组（P0.01 ） ；肺岩宁方组和综合治疗组 pAkt蛋白表达明显低于模型组（P0.05
3、 ） 。结论：益气养精法为主的肺岩宁方可抑制肺癌肿瘤生长，并与顺铂有协同作用。肺岩方对 HIF12蛋白表达的抑制作用可能与下调 pAkt表达有关。 【关键词】 益气养精; 肺岩宁方; 人肺腺癌 A549; 缺氧诱导因子1, 亚基; 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 ; 裸鼠Objective: To observe the effects of Feiyanning Decoction, a compound traditional Chinese herbal medicine, in inhibiting the growth of transplanted A549 tumors in nude m
4、ice and the expressions of pAkt and HIF1 in A549 tumors. Methods: Thirtytwo nude mice were transplanted with human lung adenocarcinoma cells (A549 cells) to make the mice model, and then randomly divided into four groups: untreated group (n=8), diamminedichloroplatinum (DDP) group (n=8), Feiyanning
5、group (n=8) and DDP plus Feiyanning group (n=8). The nude mice in DDP group and DDP plus Feiyanning group were treated with DDP 0.1 mg by peritoneal injection on the 1st, 3rd and 5th day after model establishment. The nude mice in the Feiyanning group and the DDP plus Feiyanning group were treated w
6、ith Feiyanning Decoction for 21 days. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the expression of HIF1 mRNA in tumors, and immunohistochemical method 3was used to detect the expressions of pAkt and HIF1 proteins in tumors. Results: The inhibition rates of tumor in Fe
7、iyanning group and DDP plus Feiyanning group were 34.17% and 64.38% respectively. RTPCR showed that the expression level of HIF1 mRNA in DDP plus Feiyanning group was lower than that in the untreated group (P0.05). Immunohistochemical staining showed that the optical density (OD) indexes of HIF1 in
8、DDP group, Feiyanning group and DDP plus Feiyanning group were lower than that in the untreated group (P0.01). The expressions of pAkt in the Feiyanning group and DDP plus Feiyanning group were lower than that in the untreated group either (P0.05). Conclusion: Feiyanning Decoction is effective in in
9、hibiting the growth of lung cancer. And the effect of inhibiting the expression of HIF1 protein by Feiyanning Decoction may correlate with downregulation of pAkt.Keywords: reinforcing qi and nourishing jing; Feiyanning Decoction; human lung adenocarcinoma cell strain; hypoxia inducible factor 1, alp
10、ha subunit; Akt; nude mice4缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIF ）是一类转录因子，HIF1 可以调节许多靶基因，促进肿瘤的血管生成、细胞增殖以及肿瘤转移等，磷脂酰肌醇 3 激酶（ phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K） 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶中 Akt 信号的活化可使HIF1蛋白合成增加1 。肺岩宁方是徐振晔教授研制的具有防治肺癌侵袭转移作用的经验方，本研究旨在观察肺岩宁方对 A549裸鼠移植瘤中 HIF1表达的 Akt 信号调节的影响，探求该方抑制肿瘤生长的可能作用靶点。1 材料与方法1.1 实验
11、材料1.1.1 实验动物及细胞株Balb/C 裸鼠 32 只，雄性，8 周龄，体质量（142）g ，购于上海西普尔 必凯实验动物有限公司，许可证号为 SYXK（沪）20050002。饲养于上海中医药大学龙华医院实验中心 SPF 级动物房，室温 25 ，湿度 70%，自由进食与饮水。人肺腺癌细胞株A549 购于中国科学院上海细胞生物学研究所。培养于含 10胎牛血清（fetal calf serum, FBS）的 RPMI 1640 的细胞培养基，37 、5 CO2、饱和湿度培养。51.1.2 实验仪器DU800 紫外分光光度仪购于美国 Beckman 公司，TGradient聚合酶链式反应 （p
12、olymerase chain reaction, PCR）仪购于德国 Biometra 公司，凝胶成像分析系统购于美国Alpha 公司。1.1.3 主要药材和试剂肺岩宁方由生黄芪、白术、七叶一枝花、蜂房、黄精、山萸肉、仙灵脾和灵芝等组成，由龙华医院中药房提供。常规水煎，浓缩至生药含量为 2.0 g/ml，4 保存。顺铂（diamminedichloroplatinum ，DDP） ，20 mg/瓶，齐鲁制药厂产品，批号为 04090352。RNA 提取液 TRIzol 为北京天为时代科技公司产品，逆转录（reverse transcription, RT）反应试剂盒为上海晶美生物工程有限公司
13、产品，AmpliTaq DNA 聚合酶为上海生物化工有限公司产品，兔抗人 HIF1和磷酸化Akt（phosphorylated Akt, pAkt）单克隆抗体为美国 Santa Cruz 公司产品，免疫组化 SP 试剂盒为美国 Zymed 公司产品。1.2 实验方法61.2.1 动物模型制备及给药A549 细胞悬液 0.1 ml（含细胞数目 5106 个） ，注射于裸鼠右腋部皮下。裸鼠按随机数字表法分为模型组、DDP 组、肺岩宁方组和综合治疗组（DDP+ 肺岩宁方） ，每组 8 只。2 周后观察到裸鼠皮下有小结节长出，成瘤率 100%，开始给药，给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。模型组：生理
14、盐水 0.4 ml 灌胃 21 d。化疗组：第 1、3、5 天 DDP 溶液（20 mg DDP 溶于 200 ml 生理盐水）1 ml（含 DDP 0.1 mg）腹腔注射。肺岩宁方组：中药 0.4 ml（含生药 0.8 g）灌胃 21 d。综合治疗组：第 1、3 和 5 天 DDP溶液 1 ml 腹腔注射，中药 0.4 ml（含生药 0.8 g）灌胃 21 d。停药后次日，处死裸鼠，剥取瘤块，称质量后切取部分肿瘤组织，置于 10%中性福尔马林液中固定，48 h 内常规石蜡包埋。取余下标本70 冻存，用于检测。1.2.2 观察指标1.2.2.1 抑瘤率抑瘤率= （空白对照组平均瘤质量实验组平均
15、瘤质量）/空白对照组平均瘤质量100%。71.2.2.2 RTPCR检测肿瘤组织中 HIF1 mRNA 表达 采用 TRIzol 一步法提取总 RNA，在 RT 反应体系中按照试剂盒说明进行逆转录反应，PCR 扩增参照试剂盒说明，引物由上海生物化工有限公司合成。内参照磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)上游引物：5ACA GCC GCA TCT TCT TGT GCA GTG3 ；下游引物：3GGC CTT GAC TGT GCC GTT GAA TTT5 。扩增片段长度 174 bp。HIF1 上游引物：5ACA A
16、GT CAC CAC AGG ACA G3 ；下游引物： 3AGG GAG AAA ATC AAG TCG5 。扩增片段长度 168 bp。反应条件为： GAPDH，94 变性，52.2 退火，72 延伸，25 个循环；HIF1 ，94 变性，49 退火，72 延伸，34 个循环。在紫外光凝胶成像分析系统下摄片，检测扩增片段灰值，以 HIF1基因片段与 GAPDH 片段灰度值的比值作为其相对表达水平数值。1.2.2.3 免疫组化法检测 HIF1和 pAkt蛋白表达 免疫组化法检测各组肿瘤组织中 HIF1和 pAkt蛋白表达，操作步骤参照试剂盒说明书进行。图像分析采用 CMIAS 多功能真彩色图像分析系统。每张切片随机采样测量 4 处，计算单位面积下阳性染色区域面积。1.3 统
