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1、Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬双标腺相关病毒产品说明一关于自噬及 LC31. 自噬大自噬（macroautophagy） ，也就是通常说的自噬（autophagy） ，是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分（细胞器、蛋白等）被双层膜的囊泡包裹，形成自噬体（autophagosome ） ，进而传递到溶酶体进行降解的过程。详细来说，自噬过程与内涵体途径（endolysosomal pathway）密不可分（见图 1） 。一方面，自噬体能够与晚期内体（late endosome）融合形成中间囊泡（ amphisome）最终形成自噬溶酶体（autolyso
2、some ） ；另一方面，自噬体能够直接与溶酶体（ lysosome）融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径，自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和癌症） 。饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。图 1 自噬过程及其与内涵体途径的关系(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)2. LC3 LC3（light chain 3）简称于 MAP1LC3 (
3、microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的 LC3 与酵母中的自噬相关蛋白 Apg8/Aut7/Atg8 具有同源性。LC3 蛋白合成后在其羧基端被 Atg4 剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的 LC3-I。在自噬过程中，LC3-I 会被包括 Atg7 和 Atg3 在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE ）共价结合，形成 LC3-II 并定位于自噬体膜上（见图 2） 。哺乳动物中的 LC3 可分为三种： LC3A、LC3B 和 LC3C。 其中，LC3B 作为 LC3 的一种，同样可以用作自
4、噬的分子标志。图 2 LC3 在自噬体形成中的作用(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)二自噬流检测方法细胞经自噬诱导或抑制后，需对自噬流的水平进行观察和检测，常用的技术手段见表1：表 1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总（Mizushima et al, Cell, 2010）其中，电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限；而由于自噬过程发生快速，通过 IB/WB 检测 LC3-II 水平和 GFP-LC3 的方法易受到实验进行时长的影响。想要准确检测自噬流的变化，需要多种技术手段共同使用，才能达到理想的实验效
5、果，产生具有说服性的实验结果。三Vigene 自噬双标病毒产品Vigene mCherry-GFP-LC3B 腺病毒Vigene mCherry-GFP-LC3B 慢病毒Vigene mCherry-GFP-LC3B 腺相关病毒四Vigene 自噬双标系统的工作原理未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于 mCherry 与 GFP 共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的 GFP荧光淬灭，而 mCherry 不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶
6、酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻（见图 3） 。图 3 mCherry-GFP-LC3B 双标系统工作原理(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)图 4 Vigene 自噬双标病毒载体图谱五Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬双标操作方法（一）体外实验以 2 型 AAV 病毒为例，Vigene 为您推荐的 MOI 值 104-105，是根 HEK293 细胞得出的数据，不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议您感染目的细胞前，进行预实验摸索最佳 MOI 值，推荐使
7、用有荧光的对照病毒来摸索条件。1. 为了节省病毒，推荐使用 96 孔板进行预实验。2. 将目的细胞接种于 96 孔板中，细胞融合率为 50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。3. 取 10ul AAV 病毒原液加入 90 ul 培养基中做 1:10 稀释（10 -1），以此为起点做梯度稀释直至稀释 10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。4. 取出提前准备好的 96 孔板，先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。5. 在加入病毒稀释液后，请在 12-24h 后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适，是否因为加入的病毒
8、量影响细胞状态。如果细胞没有变化，即所加病毒对细胞没有毒性，可以继续培养。6. AAV 病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。另：如果您选择的产品没有荧光标签请在 96 小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达。注：由于 AAV 组织特异性，体外感染细胞的效率比较低，所以我们强烈推荐您购买 AAV用于动物实验。（二）体内实验针对小鼠/大鼠来说，研究不同的方向有不同的 AAV 注射方法，详情可查阅 Vigene 官网。六常见问题解答1.重组 AAV 安全吗? 迄今为止，未发现野生型 AAV 有致病性。野生型 AAV，在
9、无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（ cis 质粒、辅助质粒、rep/Cap 质粒）组成。 Cis 质粒 、辅助质粒与 rep/Cap 质粒之间不具有同源性序列，因此重组 AAV 在理论上不具有复制的能力。2.哪些血清型的 AAV 可供选择？我该选用哪种 AAV 呢? 目前为您提供的 AAV 血清型为 AAV1，AAV2，AAV5 ，AAV7，AAV6，AAV8 & AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。AAVSerotype Muscle Hepatocyte Pulmonary BrainRetinal pigmented epith
10、elium Pancreas KidneyAAV1 X neuons and glial cells X X AAV2 XAAV5 lung alveolar cellsneuons and glial cells X AAV6 X X AAV7 X neurons X AAV8 X X neurons X X AAV9 X X X X X X请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表，以确定哪种血清型 AAV 更适合您的细胞。3.使用重组腺相关病毒 rAAV 传递基因的优势是什么? rAAV 病 毒 滴 度 很 高 ， 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 、 免 疫 原 性 极 小 、
11、体 内 表 达 外 源 基 因 时 间 长 。4.AAV 载体稳定吗? 如何保存 AAV 载体? 纯 化 的 AAV 载 体 在 4 或 更 低 温 度 下 高 度 稳 定 。 建 议 您 将 AAV 分 装 后 ， -80 下 长 期 保 存 。5.订制 AAV 服务，客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的 ? 您可以从我们的人源全长 cDNA 库( 17,000 预制 ORF)中挑选，或者提供您的质粒 DNA 或DNA 序列，我们将基因克隆至 AAV 载体。您还可以指定特定的融合标签和 AAV 血清型。基因沉默服务，请您提供确切的 shRNA 的序列以构建重组 rAAV 载体。我们的标准载体具有 U6 启动子和 GFP 标记。通常情况下，可为客户提供 500 ul 病毒液 11012 V.G. /mL。也可根据客户的需要，提供特定体积和滴度的产品。附：Vigene 自噬双标系统感染诱导自噬的 HEK293 细胞效果图
