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1、关于选择 MTT 法检测睾丸支持细胞细胞数目并绘制生长曲线综述李锦阳作者简介:李锦阳, 男,大学本科, 学生摘要: 目的：绘制睾丸支持细胞的生长曲线，确定其对数增长期准确时间范围，确定出最适宜染毒时间。方法：MTT 法大致检测活细胞数目，根据细胞数目绘制睾丸支持细胞生长曲线。关键词:MTT 生长曲线 睾丸支持细胞 细胞增殖前言:20 世纪 60 年代以来，随着组织培养技术的不断完善和细胞系（株）的不断建立，利用细胞系（或原代细胞）进行离体细胞生物测量的方法随之出现。细胞计数是离体细胞测量培养并绘制细胞生长曲线的基础，也是细胞培养技术中一项耗费时间精力比较大的步骤 。噻唑蓝法（3-4,5diem
2、 ethylthiazol-2,5 dipheuyl tetrazolium brom ide，M TT）是 Tim Mosman（1983）首创的一种利用比色测定活细胞量的方法，由于该法灵敏准确、经济简便因而被广泛应用于生物学和医学研究中，现在许多实验采用 MTT 进行细胞计数，测量细胞生长曲线，大大提高了细胞计数的效率。目前国内外研究睾丸支持细胞生长曲线的报道尚属少见，因此目前为止，无法准确获悉睾丸支持细胞的体外细胞培养的对数期。而细胞增殖的对数期是细胞染毒的最佳时期，确定了睾丸支持细胞的增殖对数期将会大大方便今后的研究工作者。原理：四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称 MTT。活细胞的线
3、粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，经过换算，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶物形成的量与细胞数成正比。方法：配置 MTT 溶液：称取 250mgMTT，放入小烧杯中，加 50ml 培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌 30min，用 0.22um 的微孔滤器除菌，分装，4保存备用，两周内有效。接种细胞：将已经制成细胞悬液的睾丸支持细胞和其中混杂的生精细胞计数，使之达到每孔 100010000 的细胞浓度接种与 96 孔
4、培养板中（每孔体积 200ul） ，按照观察期限 7 天，共计分装 7 个板（注意每隔 48 小时左右换液一次，避免细胞因营养物消耗完毕影响生长，造成测定误差）培养细胞：将培养板移入 CO2 孵箱中，在 37、5% CO2 及饱和湿度条件下培养。呈色：以接种细胞开始，每隔 24 小时取出一板，每孔加入 MTT 溶液（5mg/ml）20ul，37孵箱中继续孵育 4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入 150ul DMSO 缓慢十字振荡 10min，使结晶物充分溶解。比色：选择 490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
5、小结目前细胞增殖检测方法常用的有 MTT 法, 3H-TdR(氚胸腺嘧啶核苷)标记法、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)ELISA 法、CCK-8 等，MTT 法具有简便、经济、安全等特点但操作繁琐需要加入 DMSO 溶解甲臜颗粒，而且往往因溶解不全而对实验结果造成影响. 3H-TdR 掺入法虽然灵敏度搞、特异性强、稳定性好，但是其操作步骤多，存在放射性危害等问题而被限制使用。近年来发展起来的一种新型检测方法 CCK-8(counting kit-8),其原理为活细胞线粒体脱氢酶转发的黄色结晶为高度水溶性，不需要裂解细胞，可以直接闭塞，操作简单，准确性相对有所提高。有实验表明，CCK-8 灵敏度
6、高于 MTT 法，而且细胞可以重复利用， 大大减少了工作量，其实用性较 MTT 法高，预计在以后的科学研究中将会一步步取代 MTT 法广泛用于细胞计数。本实验选择 MTT 法计数睾丸支持细胞并据此绘制其生长曲线，一是 MTT 法被使用近三十年来，是科学研究中最为广泛选取的方法，具有可靠性和经济性。参考文献：侯春梅,MTT 和 CCK-8 法检测悬浮细胞增殖的比较。周思朗，SRB 法与 MTT 法细胞计数应用比较。胡珊，MTT 法测定几种农药组合联合作用初探。何国龙，MTT 法测定异搏定联合化疗药物对胶质瘤细胞 U251 化疗敏感性评估苏秀莉，MTT 法检测香叶木苷对脐静脉内皮细胞增殖抑制的影响杜伟伟，MTT 检测肾疏宁含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用熊建文，MTT 法和 CCK-8 法检测细胞活性之测试条件比较吴窈画，MTT 法检测细菌细胞数的主要影响因素分析刘苹，MTT 法与 BrdUELISA 法检测成纤维细胞增殖的可靠性比较朱文菁，MTT 法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力赵斌，小议在 MTT 法测细胞增殖抑制率中 IC_50_的计算方法
