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1、多聚酶链式反应（PCR）扩增 DNA 片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测一、实验目的：1、了解 PCR 技术的基本操作2、理解 PCR 的原理3、讨论 PCR 的应用二、实验原理：PCR 是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增 DNA 片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行 DNA 的解旋和聚1、PCR 反应组分细胞内 DNA 复制条件分析：条件 参与的组分 在 DNA 复制中的作用 实验条件/材料模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 模板 DNA原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 dNTP mixture酶 DNA 聚合酶 催化合成 DN
2、A子链 Taq DNA 聚合酶酶 解旋酶 打开 DNA 双链 温度控制引物 一小段单链 DNA 或RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 引物 I 引物 II此外，试验中用到的还有 Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为 Taq酶提供合适的 PH 条件。2、PCR 反应条件PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR 仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR 一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸。(!)变性（模板 DNA 解旋）模板 DNA 经加热至 90以上。一定时间后，使
3、模板 DNA 双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。(2)复性（退火）模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降到 50左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。(3)延伸DNA 模板引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的 DNA 链。循环数 变性 复性 延伸第一次（预变性） 94C，30s 30 次 94，20s 52，20s 72，20s最后一次（保温） 72，30s3、PCR 产物的检测(1)紫外分光光度计DNA 在 260nm 的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏
4、水的对比进而计算扩增出 DNA 的含量。(2)琼脂糖凝胶电泳DNA 在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与 DNA 片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的 DNA。在有 DNA marker（不同已知碱基对大小的 DNA 片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的 DNA 片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的 DNA 片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的 DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与 DNA 嵌合，一起电泳，DNA图谱观察
5、仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA 大小成正比。三、实验仪器及试剂7 种 PCR 组分 微量可调移液器 离心管 PCR 仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml 锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸四、实验步骤1、DNA 体外扩增(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I 和引物 II 的离心管内用移液器各加入 40ul 双蒸水（ddH 2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。(2)向装有 Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分：10x Buffer 50 LMgC
6、l2 50 LdNTP mixture 20L上游引物(引物 I) 25L下游引物(引物 II) 25 L模板 DNA 25 LddH2O 290L原有的 Taq DNA 聚合酶有 15ul，此时混合液体系共计 500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）(3)共分 25 组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取 20ul 的上述混合液于 0.5ml 的离心管中，加入 15ul 的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到 PCR 仪上进行 DNA 扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测 D
7、NA（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制浓度为 1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶 2 块。在锥形瓶中，称取 1g 的琼脂糖粉，加入 100ml 1x 电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至 60 ，倒入电泳槽中（每块胶 50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入 1x 电泳缓冲液，以没过胶面 2 mm 为宜。（5）将 80ul 的 6xLoad
8、ing Buffer 加入到 80ul 的核酸荧光染料中，按 1:1 比例混合。（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取 20ul 样品于另一 0.5ml 的离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加 1ul 的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取 10ul 缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为 80 V，电流最大。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。（8）取出凝胶块，在 DNA 图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。3、紫外分光光度计检测 DNA
9、 含量（1）最后 1 组取 2ulPCR 反应液，加入 98ul 蒸馏水，将样品稀释 50 倍。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长 260nm 处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入 DNA 稀释液 100ul 至比色杯中，测定 260nm 处的光吸收值。（4）根据下面的公式计算 DNA 含量：DNA 含量（ul/ml）=50*（260nm 的读数）x 稀释倍数五、注意事项1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达 16000r/min，如果这时打开离心机上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。另外，离心管一定要对称放置。2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到 80V，大大超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。
