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1、燕麦中可溶性膳食纤维(-葡聚糖)的提取燕麦是世界八大粮食作物之一,也是我围北方各省重要的小杂粮作物.燕麦oats不但营养价值高,而且医学研究证明,常吃燕麦有降血脂,降血糖和减少心血管疾病的作用.所以美国食品和药物管理局许可在商标或广告上宣传燕麦的降低胆固醇,预防心脏病的作用.国内外科学研究认为,燕麦的保健功能主要归功于燕麦中可溶性燕麦纤维-葡聚糖.它是对人体健康十分有益的种可溶性膳食纤维(SDF), 这种可溶成分在燕麦麸中的含量远高于燕麦胚乳,在燕麦麸中为 6.6%11.3%.在去皮的燕麦粉中为3.0% 5.4%.燕麦麸中的 葡聚糖含量在 4%10%之间,且可溶部分占 65%90%.由于目前国
2、内对燕麦 葡聚糖的提取研究不多.大量的燕麦麸仅作为饲料用,经济效益不高.因此积极开展对燕麦麸的深加工利用,进行 葡聚糖的提取和研究,有着重大的现实意义和良好的应用前景.因此.如果将过去认为是废物的燕麦麸进行深加工利用,对开发保健食品或功能食品具有十分广阔的前景. 1 实验方法1.1 原料的预处理1.1.1 可溶性膳食纤维物质(-葡聚糖)的富集提取燕麦中的可溶性膳食纤维或 -葡聚糖,关键是要明确 -葡聚糖位于燕麦籽粒中的部位.国外 Wood and Fulcher.燕麦,化学和工艺中表明 -葡聚糖主要存在于胚乳细胞壁中,在次糊粉层中大量浓缩.这就说明可以对燕麦经过研磨,将富集可溶性膳食纤维物质(
3、-葡聚糖) 的麸皮分离出来.但在除去胚乳时必须小心防止次糊粉层的胚乳细胞壁过多地随面粉分离出去.1.1.2 研磨燕麦粉燕麦清理研磨燕麦麸皮用布勒试验磨粉机装置对燕麦进行研磨,制成 60%的燕麦粉和 40%的燕麦麸皮,麸皮中富集 -葡聚糖.1.2 燕麦麸中可溶性膳食纤维(-葡聚糖)的提取工艺燕麦麸粉碎过筛(60 目)加水搅拌提取(调 pH9.0,70)离心收集上清液 去蛋白( 搅拌下调 pH 至 4.5 并静置) 离心收集上清液醇析(调 pH 至 7.0,80%酒精沉淀)离心收集沉淀,干燥葡聚糖粗品提取后的物质溶于水,不溶于乙醇.故可以用乙醇进行醇析.1.3 可溶性膳食纤维的定测方法实验中使用可
4、溶性膳食纤维的测定方法.1.4 -葡聚糖的测定方法:50mg 试样中加入 1m180%酒精润湿,之后再加入 20m1 醋酸钠缓冲液(pH5.5), 沸水浴溶解; 取出后 50 水浴中恒温 10min,加入 40U葡聚糖酶反应 1h;冷却到室温,定容至 100m1,取 0.1m1(两份),加入 0.2U葡萄糖苦酶,50反应 10min;葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,推算 葡聚糖含量,由此求得葡聚糖纯度 .2 实验结果分析2.1 各因素对 葡聚糖提取率的影响2.1.1 粉碎粒度对提取率的影响麸皮粒度对提取率有一定的影响,粒度越大,大部分 葡聚糖尚被颗粒所包裹,不能被提取出来 ;但粒度太小,澄清困难
5、,粗品中淀粉含量多,色泽不佳.故选择其粒度为 4060 目.2.1.2 料水比对提取率影响根据液固萃取基本理论,增大提取液的量将有利于溶质的溶出.但过大的液固比对实际生产过程来说是没有意义的,不仅增加水的消耗及后续的浓缩成本,而且容易导致加工过程中溶质的丢失.本实验研究 60,pH9.0, 提取时间 1h 条件下,料水比在 1:91:21 之间提取情况.料液比1:91:121:151:20得率3.13.33.43.52.1.3 提取温度对提取率影响液固比,pH,提取时间分别固定为 15,7.0,1h,研究提取温度的变化对提取率影响. 温度40506070得率1.52.53.24.22.1.4
6、pH 对提取率和色泽的影响 在 50下提取 1h,液固比为 15 的条件下研究 pH 对提取率影响 一般在稀碱条件下进行提取,这是由 葡聚糖本身的碱溶性质决定的 .随着 pH 的升高,提取率也增加,同时提取液颜色也逐渐加深. 选择 PH 值为 9.02.1.5 蛋白的去除麸皮中存在大量蛋白会造成制品纯度不高,选择等电点沉淀法去除蛋白.在搅拌下调 pH 至 4.5 并静置,用离心法去除沉淀.2.2 粗品的纯化2.2.1 淀粉的检测准确称取 NSP 样品 0.1g,加水定容至 100ml,取一滴于白瓷扳上,加碘液 1 滴,如碘液不显蓝色,表明样品中不含淀粉,可直接进行纯化.若碘液呈显蓝色,则表明混
7、有淀粉,需进行纯化预处理.2.2.2 纯化的预处理 由于在热水浸提过程中,随着淀粉在提取液中的糊化,导致它和多糖一起提取出来,因此有必要在制备过程中用酶法除去淀粉.淀粉的去除效果以碘液与提取液反应所产生的颜色变化作为评判标准,颜色越浅表示淀粉残余含量越低,若无颜色变化,即可认为淀粉已水解完全.将提取液用 O.1mol/L Na0H 调 pH 至 5.56.O,于恒温水浴上加热至 92,加 lml -淀粉酶溶液恒温酶解,并经常搅拌,酶解过程中淀粉检测,直至没有蓝色为止.二,-葡聚糖的功能性1, 一葡聚糖降血糖功能:研究结果表明:用含 5%燕麦可溶性膳食纤维饲料喂养的实验组大鼠,其血糖含量明显低于
8、对照组,仅为对照组的 68.9%.该结果与国外文献相关报道一致.该结果表明:NSP 是莜麦中降低血糖的主要有效成份之一 ,它能使高血糖大鼠体内血糖明显降低.该结果也为阐明莜麦血糖指数最低的原因提供了有益的参考:由于莜麦中所含的 NSP 是富强粉的 9.0 倍,大量 NSP 的存在而使得莜麦粉的血糖指数很低 oNSP 降低血糖的原因可能是因为 NSP 的存在增加了胃内容物的粘滞性,使得胃排空延迟,从而防止了爱后血糖急剧上升,同时可镕性膳食纤维进人小肠,又使小肠内不搅水层加厚而降低了糖的吸收,因此阳 P 具有降低血糖的功能 . 2 一葡聚糖降血脂作用 一葡聚糖对高血脂人群有明显的降低胆固醇作用.
9、可以用四种代谢机制来解释这一作用结果 :(1)这种可溶性淀粉在肠道内与胆酸结合,使循环至肝的胆酸量减少.这样,可促使胆固醇分解胆酸,来满足内源代谢和循环的需要.只有一小部分胆固醇与胆酸结合随粪便一起排外,所以,经粪便排除并不是降低胆固醇的主要原因.(2)可溶性淀粉在肠内微生物菌丛的作用下发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)乙酸 ,丙酸和丁酸.这些 SCFAs 经过门静脉被吸收,通过抑制 HMGCoA(胆固醇生物分解作用的限速酶 )的活力,可以阻止肝胆固醇的合成 ,提高 LDLC 的分解作用.但是,据最新研究结果表明.只有 SCFAs 之丙酸有作用.(3)可溶性淀粉可以减缓胃的排空,这样可以减少由于
10、多食引起的血中胰岛素的提高.这一作用可以减少通过 HMGCOA 合成肝胆固醇.(4)燕麦可溶性淀粉可提高肠道内粘度,从而抑制膳食中脂肪的吸收,其中包括胆固醇.当粘度增加后,食物含有过量的水,从而减缓了其运动速度.植物蛋白质提取的三种 protocols1. TCA/丙酮法：（1）取 4g 果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。（2）加入 12.5%冰冷的 TCA/丙酮（含 0.07%-巯基乙醇），匀浆液在-20 C 下放置 3h，纱布过滤。（3 ）滤液在 20000g 离心 30min，收集沉淀。（4 ）用冷丙酮洗 3 次，沉淀在 4C 下干燥，备用。2. 匀浆法：（1 ）称取 4g 果肉，用液氮
11、在研钵中研磨成粉。（2）加入 4ml 的匀浆缓冲液(匀浆液中含有 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及 1% Triton X-100)，继续研磨。（3 ）匀浆液 20000g 离心 30min。（4）将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为 10%TCA 溶液，4C 下放置 2 h。（5）20000g 离心 40min，收集沉淀。（6）用冷丙酮洗 3 次，沉淀在 4C 下干燥，备用。3. 酚提取法：（1 ）称取 4g 果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。（2）加入 4ml 的匀浆缓冲液
12、(匀浆液中含有 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及 1% Triton X-100)，继续研磨。（3 ）匀浆液 20000g 离心 30min。（4）在上清液中加入等体积的 pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀， 10000g，4C 下离心 30min，上层为水相，中间白色物质为杂质，下层为酚相。（注：当提高匀浆缓冲液中 sucrose 的浓度到 1M 时，酚相会出现在上层。）（5 ）回收酚相，加入 5 倍体积含 0.1M 乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀，-20C 下过夜，
13、沉淀蛋白。（6）沉淀用含 0.1M 乙酸铵的预冷甲醇洗 2 次。预冷丙酮洗 2 次。（7）沉淀在 4C 下干燥，备用。植物组织蛋白质提取方法 1 U7 o) l; C! f) N3 V方法一：1、根据样品重量（1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入） ，准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时） 。3、用离心机离心 8000rpm 40min4或 11100rpm 20min44、提取上清夜，样品制备完成。0 i+ k4 q7 c& Y/ 蛋白质提取液：300ml) u# G& K P D0 N1、1M tris-HCl
14、（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对 SDS-PAGE，垂直板电泳！( + N! h1 r X) A9 方法二：三氯醋酸丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积 3 倍的提取液在-20的条件下过夜，然后离心（48000rpm 以上 1 小时）弃上清。; Z$ i* G- c3 n O& 7 h* N3、加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的 -巯基乙醇） ，摇匀后离心（48000rpm 以上 1 小时） ，然后真空干燥沉淀，备用。3 h, T0 O) e8 p8 |4、上样前加入裂解
15、液，室温放置 30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（158000rpm 以上 1 小时或更长时间以没有沉淀为标准） ，可临时保存在 4待用。5、用 Brandford 法定量蛋白，然后可分装放入 -80备用。* J% Z8 g2 h7 w9 药品：提取液：含 10%TCA 和 0.07%的 -巯基乙醇的丙酮 3 v1 m L# X$ 裂解液：2.7g 尿素 0.2g CHAPS 溶于 3ml 灭菌的去离子水中（终体积为 5ml） ，使用前再加入 1M 的 DTT65ul/ml。! w; ( T6 a H$ D这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电
16、泳的条带会减少！9 N7 i( x/ X* , g蛋白质样品制备 7 m* r% Z; O6 9 Y: O o- U, p/ F秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等（1986）的方法进行。 100mg 材料剪碎后加入 10mg PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮 )及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入 1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含 10mM 即 0.07%-巯基乙醇） ，混匀，-20 沉淀 1 小时，4，15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于 1.5ml 冷丙酮(含 10 mM-巯基乙醇 )，再于-20沉淀 1 小时，同上离心弃上清， （有必要再用 80丙酮(含 10 mM-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每 mg 干粉加入 20l（可调） UKS 液9.
