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1、1普通 PCR 与 TDPCR在临床医学科研中应用价值的比较【摘要 】 目的 比较普通聚合酶链反应（ PCR）与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR) 在临床医学科研中的价值。方法 以人类外周血基因组 DNA 为模板，设计 VHL 基因 3 个外显子的 3 对引物，根据普通 PCR 及 TDPCR 原理设计包括 3 个外显子片段在内的 PCR 程序，通过试验选择 PCR 最佳反应条件，在同一程序中分别对 3 个片段进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，纯化后 PCR 产物测序分析两种试验方法的差别。结果 电泳检测及纯化后 DNA 产物测序分析均显示 TDPCR 扩增产物条带
2、特异性、效率较普通 PCR 扩增产物高。结论 成功建立了 TDPCR 方法，TDPCR 方法较普通 PCR 更为高效实用，为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段。 【关键词】 基因 聚合酶链反应 降落聚合酶链反应Abstract： Objective To compare the ordinary polymerase chain reaction (PCR) and touchdown (TD)PCR in clinical medical research. Methods We used genomic DNA from human peripheral blood as templ
3、ates and designed 2three pairs of primers of VHL gene three exons. On the basis of the principle of PCR and TDPCR, we designed the programs, including the three exons. We chose the better reaction conditions through the PCR tests. The same programs were carried out on three fragments. The PCR produc
4、ts were detected by gel agarose electrophoresis. We analyzed the difference between the two methods by sequencing purified PCR products. Results It was indicated that TDPCR was more specific and effective than ordinary PCR, according to electrophoresis detection and sequencing analysis. Conclusion T
5、DPCR, which acts as a rapid and reliable method, is more efficient than ordinary PCR for clinical gene mutation screening.Key words： gene; polymerase chain reaction; touchdown polymerase chain reaction自从 20 世纪 80 年代中期以来，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR) 作为一种体外扩增 DNA 的方法，在分子生物学、法医学及一些人类基因疾病诊断等方面起
6、到越来越重要的作用。PCR 所具有的 3 个突出的特点（即选择性，特异性和快速性） ，使得 DNA 的克隆和操作变得十分简单。目前在一些临床基因突变3筛查研究中，PCR 作为基本实验手段，得到了广泛的应用,尽管如此，许多 PCR 实验中不但经常出现假阳性，而且实验结果往往并不太令人满意，也会造成无 PCR 产物，或电泳中出现大量非特异性二聚体条带。降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR) ，最初是用于克服 PCR 中的假引发，作为一种行之有效的 DNA 体外扩增方法，在许多普通 PCR 无产物的基因扩增，都采用 TDPCR，因此我们在VHL 基因突变筛查中使用了普通 PCR
7、和 TDPCR 两种方法，并同时使用了 TaKaRa Taq Hs 进行了实验，期望能够得到良好的实验结果及建立 TDPCR 方法。1 材料与方法11 PCR 扩增引物及模板 引物设计参考文献1 ，由大连宝生物工程有限公司合成。两组实验均以 1 例健康人类外周血基因组 DNA 为模板，外周血 DNA 提取采用大连宝生物工程有限公司D9081 血液基因组提取试剂盒,严格按照说明书提取基因组 DNA。12 PCR 扩增条件 50 l 反应体系中包括：大连宝生物工程有限公司 DR028A PCR 混合浓缩试剂（Premix Taq Hot Start Version） 25 l，100 mol/L
8、上下游引物各 0.2 l，基因组DNA100200 ng，灭菌超纯水 20.6 l。413 PCR 扩增试剂及仪器 本次实验中使用的 DR028A PCR混合浓缩试剂中含有的 TaKaRa Taq Hs 是抗 Taq 抗体和 TaKaRa Taq 的混合物，高温变性前抗 Taq 抗体与 Taq 酶结合，抑制聚合酶活性，能在低温条件下抑制引物的非特异性退火及引物二聚体的非特异性扩增，抗 Taq 抗体在 PCR 反应最初的 DNA 变性步骤中变性，无需特殊失活处理，在常规 PCR 条件下即可使用，同时 PCR 扩增产物 3末端含有一个 “A”碱基，可直接连接 T 载体克隆。PCR所用仪器为美国 A
9、BI 公司 GeneAmp PCR System 9700 型。14 设计降落 PCR 程序 参考文献2 所建议的 TDPCR引物设计原则从高于融解温度(Tm) 值 10 ，每次降低 1 ( 最终降至 Tm 值) 并做适当修改，对 3 对引物的 Tm 值进行预测，并根据全部退火温度值设定 PCR 循环程序中的温度变化范围，为照顾到3 个片段，退火温度在最高 65 最低 55 的范围内，比较温度梯度以每降低 1 循环 2 次、最后在 6072 再循环 15 次等一系列程序的扩增效果。15 PCR 程序151 普通 PCR 程序 循环参数为 95 预变性 5 min，95 变性 45 s，第 1、
10、2 和第 3 外显子的退火温度分别为63 、59 、57 ，退火 45 s，72 延伸 45 s，30 个循环后，572 延伸 10 min。152 TDPCR 程序 94 预变性 3 min；94 46 s；65 30 s，每次下降 1 直到 55 ，每个温度上进行 2 轮循环反应；60 45 s，72 45 s，再循环 15 次；72 延伸 10 min；PCR 产物在 4 下保存。16 电泳 所有 PCR 产物均在 2.0%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳，固定电压 100 V。17 纯化及测序 使用上海生工技术有限公司 DNA 胶回收试剂盒 SK1132 纯化 PCR 产物后，送该公司测序
11、，所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为 BigDye terminator v3.1。2 结果本次实验中用于扩增 VHL 基因的 3 个外显子和测序的引物见表 1。TDPCR 产物电泳结果未见非特异性二聚体，目的条带清晰明亮，见图 1。普通 PCR 产物电泳结果可见大小约 100 bp 左右的非特异性二聚体，同时加样孔下方带有部分片状拖带产物，目的条带较明亮清晰，见图 2。TDPCR 产物纯化后测序结果准确可靠，基本未见干扰波，见图 3。普通 PCR 产物纯化后测序结果较准确可靠，在碱基 G 与 A 可见一蓝色干扰波，见图 4。6表 1 用于扩增 VHL 基因的 3 个外显子
12、和测序的引物（略）F：正向；R：反向图 1 TDPCR 产物电泳结果（略）图 2 普通 PCR 产物电泳结果（略）图 3 TDPCR 产物纯化后测序结果（略）图 4 普通 PCR 产物纯化后测序结果（略）3 讨论1991 年 Don 等报道的 TDPCR 代表一种优化方法，其与普通 PCR 操作基本一致，只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，一组反应程序可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段，并获得理想的扩增效果。该方法的基本原理是在设定程序时选择退火温度高于计算的 Tm 值 10 ，随着循环的进行逐步降至 Tm 值，最终低至 Tm 值或低于 Tm 值 5 。这一方法可保障
13、第一个引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)7之间，任何不同的变性温度与不同的复性温度之间循环，能得到 2倍增高的正确或不正确的产物，在随后的退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。最初设计 TDPCR 是为了降低普通 PCR 中出现的假阳性 ，因此 TDPCR 常用于存在假阳性的临床检测。此后 Piraee M 等人应用并改进了上述技术35。国内此项技术应用较少，仅见个别报道。万兵等在构建人CDl37hlgGlFcpCDNA3 融合蛋白真核表达载体过程中运用TDPCR 扩增目的基因6。张贵星等人在克隆盐藻 D.bardawil 的胡萝卜素生物合成相关(carotene
14、 biosynthesis related，cbr)基因的启动子过程中，对 TDPCR 进行了改进7。季策等人在建立拟南芥 AtSUC9PCR 反应体系时运用了 TDPCR 技术8 。我们在本次实验中比较了普通 PCR 和 TDPCR 间的特异性差别，并使用了含有抗 Taq 抗体的 Taq 酶（即 TaKaRa Taq Hs）以期待达到 PCR 反应的最优化条件。实验结果均表明，在同样的最优化条件下及使用同一模板（1 例健康人类外周血基因组 DNA）情况下，普通 PCR 产物中仍出现非特异性二聚体及部分片状拖带，可能导致测序结果出现部分干扰波，TDPCR 产物中未见非特异性二聚体及部分片状拖带
15、，目的条带清晰明亮，由此可以证实 TDPCR完全可以用于降低或避免由以下原因所致的假阳性：空气中的小片段核酸污染；短序列引物；非特异性扩增带；Tm(变性温度)值具有一定差距的 1 对引物；复杂的模板 DNA，如基因组 DNA。同时也8说明 TDPCR 反应的扩增效率及特异性较普通 PCR 高，基本达到本次实验最高水平。综合比较普通 PCR 和 TDPCR，我们认为前者虽然程序简单，在一般的 PCR 仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阳性；而 TDPCR 虽然程序复杂，并需要 PCR 仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阳性，且在同样的工作条件(比如最佳 Mg2浓度、Taq 酶
16、)可扩增出更高特异性的产物。此次实验证实成功建立 TDPCR 的方法，仅需应用一套温度程序扩增，既可对 VHL 基因全部 3 个外显子进行检测，并能在 1 d 内完成。本方法的建立为 VHL 基因的突变筛查分析提供了快速可靠的方法，具有一定的临床研究使用价值。【参考文献】1 周大海,王养民, 蓝 天,等. 一个单纯家族性嗜铬细胞瘤家系的 VHL 基因突变筛查J.中华医学遗传学杂志，2007,24（4）：365-368.2 Huang XQ, Cloutier S.Heminested touchdown PCR combined with primertemplate mismatch PCR for rapid isolation and sequencing of low
