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1、1药物中石油醚残留量测定方法探讨李平 1，李慧义 2，陈东英 *1，迟颖红 1，胡亮 1(1. 中国科学院上海药物研究所质控组，上海 201203；2. 中国药品生物制品检定所，北京 100050)摘要 目的 对药物中石油醚残留量的定量测定方法进行探讨。 方法以两种市售石油醚(60-9 0)为例，建立气相色谱条件，分析其组份分布，结合其它常见几种有机溶剂的分离情况，对石油醚在药物中的残留量定量测定方法予以探讨。结果在可能的残留限度范围内，石油醚(60-90) 主要组分响应之和和石油醚的浓度呈良好线性关系。在和其他常用残留溶剂的组合分离中，各个溶剂的检测回收率令人满意。 结论采用石油醚(60-9
2、0)的主成分峰面积加和计算来表示石油醚在药物中的残留量，可以减小不同厂家生产石油醚的各组分含量差异，满足对药物中的残留控制的要求。关键词 石油醚；残留量；气相色谱；方法探讨石油醚经常作为非极性溶剂广泛应用于原料药的合成或天然药物有效成分的提取中。为了有效控制溶剂残留，保证用药安全性，国内外药典对于溶剂残留限度都作了较为详尽的规定。在 ICH 指导原则 1和中国药典 2005 版 2附录 VIII 中都将石油醚列为没有足够毒性资料的第四类溶剂，但是要求药品生产企业在使用时应提供该类溶剂在制剂中残留水平的合理性论证报告。与其他具有单一组份或具有固定组成的有机溶剂相比，石油醚是由低分子烷烃组成的混合
3、物，其组成比例没有特定性。在现有的对于石油醚的残留量检测文献报道中 3-6，有仅采用正己烷的响应或者以石油醚的谱峰总和作为计算依据，但是对于石油醚计算依据的选择和相关讨论，未见报道。因此如何在药物中进行残留量计算及限度控制，应具有特殊性和可探讨性。在常用的石油醚(60-90)中，正己烷组份存在严重的毒性，是药典中限度规定最为严格的小分子烷烃。如果长期接触正己烷可致周围神经炎；而高浓度吸入则会出现头痛、头晕、恶心、共济失调等症状，重者神志丧失甚至死亡 7-8，因此对于石油醚(60-90) 的限度检测方法必须参考正己烷的限度规定。本文拟以两种市售石油醚(60-90)为例，建立气相色谱条件，分析其组
4、份分布，结合原料药中含有的其它常见几种有机溶剂的分离情况，对石油醚在药物中的残留量定量测定方法予以探讨。1 仪器与试药2Agilent 6890 型气相色谱仪，附 Agilent 7683 自动进样器和氢火焰离子化检测器 (Agilent 科技有限公司，美国) ；ZB-624 毛细管气相色谱柱， 60m0.32mm1.80m (phenomenex，美国)。石油醚(60- 90) A (AR，国药集团化学试剂有限公司)，批号：F20060206；石油醚(60-90 ) B (AR，上海凌峰化学试剂有限公司 )，批号：051005，060417 。其他未提及溶剂均为分析纯。原料药TD(批号 06
5、0422)。2 色谱条件色谱柱为 ZB-624 毛细管色谱柱(60m0.32mm1.80m) ；进样口温度为 200；检测器温度为 300；初始柱温为 30，保持 25min，然后以 20/min 升温至 220，保持 20min；载气为高纯氮气(99.999%) ；进样量为 1.0l；分流比为 3:1。3 溶液配制供试品溶液制备：取原料药 TD 约 0.25g，精密称定，置于 5ml 容量瓶中，以二甲亚砜溶解稀释并定容，摇匀，作为供试品溶液。对照品溶液制备：精密称取甲醇、乙醇、二氯甲烷、石油醚(60-90) 、乙酸乙酯、四氢呋喃以及 1,4-二氧六环适量，用二甲亚砜定量稀释制成每 1ml 中
6、分别含甲醇 300.0g、乙醇 500.0g、二氯甲烷60.00g、石油醚 (60-90)29.00g、乙酸乙酯 500.0g、四氢呋喃 72.00g、1,4- 二氧六环 38.00g的溶液，作为对照品贮备液。取对照品贮备液用二甲亚砜定量稀释一倍作为对照品溶液。4 石油醚(60-90)组分分布研究分别对两家市售石油醚(60-90 )进行考察。通过对照品定位法确认主成分 PE-2 为正己烷(图 1)。各组份对应的面积归一化含量结果见表 1。表 1 石油醚(60-90)的各主要组分面积归一化含量分布石油醚 (60-90 ) A 石油醚 (60-90 ) B 批号组份（保留时间） F20060206
7、 F20060206 051005 060417PE-0: 24.68min 10% 10% 17.70% 18.01%PE-1: 26.59min 19.66% 19.72% 16.52% 16.65%PE-2: 28.05min 52.76% 52.85% 25.36% 25.37%PE-3: 30.48min 10.14% 10.32% 10% 10%3从表 1 我们可以看出不同厂家生产的石油醚(60-90) 在各组份分布上具有差异性，而同一厂家生产的石油醚(60-90 )具有基本一致的组份分布。考虑到石油醚(60-90)具有较强的挥发性，我们进一步比较了同一厂家及时密闭放置的石油醚(6
8、0-90) 和开瓶后未及时密闭的石油醚(60-90)组份比例之间的差别，结果表明两者具有较大的差异性。这提示在石油醚(60-90) 的贮藏和使用中一定要注意及时密闭保存。5 线性考察精密量取对照品贮备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0ml 分别至 10ml 容量瓶中，用二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，依次作为线性 16 号溶液，依法进行测定，按“2”项下进行分析。根据“3”项供试溶液浓度和正己烷的限度要求，在石油醚(60-90) 的限度溶液 (14.5g/ml)中仅 PE-1、PE-2、PE-3 色谱峰的信噪比(S/N)是大于 10，可以被准确定量计算，故在计算石油醚(60-90
9、)的峰面积之和(PE-sum)时以 PE-1、PE-2、PE-3 对应的峰面积进行加和计算。若分别以正己烷(PE-2)峰面积或者以 PE-sum 作为纵坐标(Y)，以石油醚(60-90)浓度作为横坐标(X)进行线性拟合，其线性关系分别为 Y=1.6939X-1.3365 (r=0.9994)和 Y=2.6709X-2.0519 (r=0.9995)。结果表明，在 2.84028.40g/ml浓度范围内，无论 PE-2 或 PE-sum 均能和石油醚(60-90) 浓度呈良好的线性相关性( 图 2)。因此关于石油醚(60-90)的定量，应该既可通过单一组分的线性方程计算，也可以各主要组PE-0P
10、E-1PE-2PE-3图 1 两种市售石油醚(60-90) 组份分布气相色谱图PE-0PE-1PE-2PE-3石油醚 A石油醚 B4分之和的线性方程进行计算。但是我们认为，尽管在建立色谱分离条件时必须考虑正己烷的有效检出，而且正己烷在各批待测的石油醚(60-90) 中含量最高，但是为了减小不同厂家或不同批号之间的石油醚(60-90)组份差异，若以石油醚(60-90)各主要组份的峰面积响应之和计算应该更加合理， 能够更准确地表示出待测药物中可能含有的石油醚(60-90) 的残留量。在以下相关计算中如未加特殊注明，石油醚(60-90)的响应峰面积均以 PE-sum 表示。6 石油醚(60-90)
11、溶液的稳定性为了考察石油醚(60-90)二甲亚砜 溶液在没有严格密闭状况下的组份变化情况，配制了一定浓度的石油醚(60-90 )二甲亚砜溶液 (含石油醚 4.008mg/ml)。移取适量至进样小瓶，按“2”项重复进样。由于进样瓶上的密封垫被进样针扎出针眼，将不再具有保证密封性。结果表明在 48hr 内，石油醚(60-90 )的总峰面积明显下降，其中正己烷(PE-2)峰面积下降超过 50。通过面积归一化计算，PE-1、PE-3 的百分含量逐渐增加；PE-0、PE-2 的百分含量逐渐下降，以正己烷(PE-2)的百分含量下降最明显，下降了约 8.4%。可以推测石油醚(60-90)挥发性很强，而且在挥
12、发过程中中各组份比例明显发生变化，提示在石油醚(60-90) 或者溶液在贮藏和使用中一定要注意密闭保存。表 2 石油醚(60-90)溶液的各主要组 份百分含量的变化组份%时间 (hr)PE-0 PE-1 PE-2 PE-30 8.42 19.66 52.76 (Area: 3986) 10.1422 8.35 20.64 49.18 (Area: 2543) 11.8948 8.12 21.35 44.36 (Area: 1536) 13.74图 2 石油醚(60-90 )的线性图谱010203040506070800 10 20 30浓 度 (g/mL)峰面积 (pA*s)PE-2PE-su
13、m57 精密度试验取线性测定项下溶液(浓度 8.52g/ml)分装不同进样瓶，依次按“2”项进行测定 6 次。在精密度数据计算时，若以 PE-2 峰面积进行计算，6 批数据间相对标准偏差 RSD 值为 3.30%。若以 PE-sum 峰面积进行计算，6 批数据间相对标准偏差 RSD 值为 3.21%。两种计算方式获得的 RSD 数值基本一致。试验结果说明在上述色谱条件下进样精密度良好，也提示在严格密闭条件下，石油醚(60-90) 的组份组成是稳定的。8 最小检测限逐级稀释对照品储备液，按“2”项，以正己烷信噪比为 23 时对应的石油醚(60-90) 浓度为最小检测限，测得石油醚(60-90)的
14、最小检出限为 0.45g/ml。9 石油醚和常见有机溶剂的残留分析系统适应性试验精密称取对照品溶液，按“2”项测定，记录色谱图，见图 3。以甲醇、乙醇、二氯甲烷、石油醚(60-90) 、乙酸乙酯、四氢呋喃以及 1,4-二氧六环计算的理论塔板数均不低于 5000，且相邻两峰的分离度均不小于 1.5。172434465图 4对照品溶液的气相色谱图 1.甲醇(12.0min), 2.乙醇(17.6min), 3.二氯甲烷(25.2min), 4.石油醚(60-90) (26.6min, 28.0min, 30.4min), 5.乙酸乙酯(31.4min), 6.四氢呋喃(32.0min), 7.1,
15、4- 二氧六环(36.6min)图 3 石油醚(60-90 )主要组份含量变化图01020304050600 22 49时 间 (hour)含量(%) PE-0PE-1PE-2PE-3610 回收率试验精密称取供试液适量，分别加入一定量的对照品贮备液，其中含有石油醚(60-90) 分别为6.816、8.520、10.22g/mL，按 “2”项进行测定，石油醚 (60-90)的平均回收率为 97.47%(表 3)，同时其它 6 种溶剂的回收率均在 100110%之间(表 4)。说明本文建立的方法可以用于石油醚 (60-90)和其它 6种常见有机溶剂的定量检测。表 3 石油醚(6090)的回收率测
16、试结果溶剂样品中含量(g/mL)加入量(g/mL) 测得量(g/mL) 回收率(%)回收率平均值(%)RSD(%)6.816 6.687 98.118.520 8.532 100.1石油醚(60-90)未检出10.22 9.624 94.1797.47 3.11表 4 石油醚(6090)和常用溶剂气相色谱分离 方法学验证参数表化合物 线性方程 相关系数线性范围(gml-1)最小检出限(gml-1)精密度 (RSD%)回收率(%)甲醇 y=1.4159x-3.0808 0.9999 6.25312.40 0.75 1.01% 103.7乙醇 y=2.0269x-4.2600 0.9999 9.92495.80 0.79 0.99%
