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1、浙江大学博士学位论文低强度微波辐射致兔眼晶状体早期损伤及发生机理的研究姓名：叶娟申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：姚克2001.11.1低强度微波辐射数兔眼晶状体早期损伤及发生机理的研究 !主!里堕墨竺LECTEMFCMPlFITCPSGJICCx4356-CFDAFRAP缩略语ABBREVIATIoNLen Epithelial CellTransmission Electron MicroscopeFlow CytometryPropidium IodideFluorescein IsothiocyanatePhospha删ylsenneGap-Junctional Intercel
2、lular CommunicationConnexin 435,6-Carboxyfluorescein DiacetateFluorescence Recovery After Photobleaching低强度微波辐射致兔眼盛状体早期掼伤及发生机理的研究 博士学位论文200低强度微波辐射致兔眼晶状体早期损伤及发生机理的研究浙江大学医学院博士研究生导 师眼科学叶 娟姚克教授摘 要f低强度微波辐射，特别是目前仍沿用的国际微波接触安全标准：10mWcm2和5mWcm2功率密度的微波是否会对晶体产生损伤作用，以及低强度微波辐射的生物学效应是否为“非热作用”，是争议较多并亟待解决的问题。本课题以lO
3、mWcm2和5mWcm2功率密度的微波辐射实验家兔眼，制作在体实验动物模型，从不同角度和水平探讨低强度微波辐射对兔眼晶体上皮细胞的早期损伤作用并研究其发生的分子生物学机理。通过透射电子显微镜观察晶体上皮细胞超微结构的变化：流式细胞技术检测晶体上皮细胞早期凋亡的发生；激光共聚焦显微镜测定晶体上皮细胞细胞间隙通讯功能状态。在组织形态、细胞和分子水平均发现了低强度微波辐射对兔眼晶体上皮细胞所造成的不可逆的早期损伤改变，这种损伤仅限于分子和细胞水平，未涉及组织、细胞大体形态的破坏和热作用下细胞热坏死及蛋白热凝固，推测为低强度微波的“非热效应”。这种改变影响了晶体正常代谢活动和生理功能状态，破坏了晶体内
4、稳态，是微波辐射性白内障发生的早期变化。故认为既定的微波安全接触标准的可靠性尚待推敲。1广低强度微波辐射致兔限量状体早期损伤及发生机理的研究 博士学位论文2001器巧了丽奢一一 一 一第一部分 低强度微波辐射致兔眼晶体上皮细胞超微结构的早期改变目的：细胞超微结构形态学变化是检测细胞损伤最客观而可靠的依据。本部分研究旨在通过透射电子显微镜，观察低强度微波辐射致兔眼晶体上皮细胞超微结构的改变，从形态学上证实损伤的存在。f方法： 1动物分组：健康无眼疾家兔16只(32只眼)。随机分为两组，分别接受10mWcm23h和5mWcm23h的微波辐射。单眼照射，另眼辐射屏蔽作自身对照。2标本制作及检测：取兔
5、眼晶体前囊膜，制成透射电镜标本。透射电子显微镜下观察晶体上皮细胞超微结构的变化，与自身对照正常眼比较。结果： 与自身对照正常眼比较，经5mWcm23h的微波辐射后晶体上皮细胞基本形态无明显改变，线粒体数量无明显减少但内嵴结构破坏，可见线粒体内充满内嵴残片。经lOmWcm23h的微波辐射后晶体上皮细胞结合疏松，细胞质内因亚细胞结构的破坏、消失而呈空泡化：线粒体数量明显减少，空泡样改变；内质网网腔扩张。lOmWcm2组晶体上皮细胞超微结构的破坏程度明显于5mWcm2实验组。叉，结论：15mWcm2和lOmWem2强度的微波辐射均对兔眼晶体上皮细胞产生了损伤，细胞超微结构形态学的改变客观证实了这种早
6、期损伤的存在。超微结构的改变最突出地表现在与晶体细胞能量代谢、物质交换密切相关的线粒体上。相同的辐射时间，微波功率密度决定了细胞损伤的程度。堡堡曼塑鍪塑墅塾墨堕墨苎苎呈塑堡望璺垄兰垫里塑里塑 堡主堂堡堕塞型!一2经5mWcm2和10mWcm2强度的微波辐射后，细胞未发生整体形态的严重破坏，无热凝固和坏死的表现，以亚细胞结构的改变为主，推测为低强度微波辐射“非热作用”的生物学效应。第二部分流式细胞技术定量检测兔眼低强度微波辐射性白内障早期损伤改变的研究目的：AnnexinV(FITC)PI双染色法流式细胞技术是目前公认的检测细胞早期凋亡灵敏而可靠的方法。本部分研究旨在通过流式细胞技术定量检测低强
7、度微波辐射后兔眼晶体上皮细胞的早期损伤改变，证实晶体上皮细胞凋亡亦是微波辐射性白内障发生的细胞学基础。f方法： 1动物分组：健康无眼疾家兔20只，随机分为两组，分别接受10mWcm23h和5mWcm23h的微波辐射。单眼照射，另眼辐射屏蔽作自身对照。2标本制作及检测：取兔双眼晶体前囊膜，用300目铜网制作晶体上皮细胞单细胞悬液，依照AnnexinVFITC试剂盒说明制作样本，流式细胞仪进行检测。结果： 15mWcm23h实验组与自身对照正常眼比较，早期凋亡细胞明显增加，差异有显著性(P001)，继发性坏死细胞数比较无明显差异(P005)，早期凋亡与继发性坏死细胞数之和即受损细胞总数与自身对照相
8、比较差异有显著性(P005)。4低强度微波辐射致兔眼晶状体早期损伤及发生机理的研究 博士学位论文200210mWem23h实验组与自身对照正常眼比较，早期凋亡细胞无显著性差异(P005)而坏死细胞明显增加，有统计学意义(P005)。经微波辐射受损细胞总数与对照眼相比，差异有非常显著性(P0001)。35mWcm2与10mWcm2两实验组组间比较，受辐射眼早期凋亡的细胞数无显著性差异(伶O05)，继发性坏死细胞数两组间比较差异有显著性(P005)。10mWcm2辐射组受损细胞总数明显多于5mWcm2辐射组，差异有显著性(Po05)。J结论： 15mWcm2和10mWcm2功率密度的微波辐射均引起
9、了兔眼晶体上皮细胞的损伤，这种损伤已被量化检测。5mWcm2微波辐射主要是诱发细胞早期凋亡改变而10mWcm2微波辐射除诱发细胞凋亡外，还引起晶体上皮细胞的坏死。25mWcm2和10mWcm2的微波对晶体上皮细胞的损伤以细胞膜磷脂正常非对称性排列顺序的破坏(5mWcm2)和细胞膜通透性改变(10mWcm2)为主。这种在细胞水平的结构变化亦支持低强度微波辐射作用的“非热效应”。第三部分低强度微波辐射对兔眼晶体上皮细胞间隙连接通讯功能的影响及其发生机制目的：研究表明晶体上皮细胞细胞间隙连接通讯(GJIC)功能障碍将导致晶体的混浊。本部分研究旨在通过激光共聚焦显微镜检测受低强度微波辐射后兔眼晶体上皮
10、细胞间隙连接通讯功能状态的变化及连接蛋白Connexin43功能定位的改变来探讨低强度微波辐射性白内障发生的可能途径和机理。堡兰曼塑茎塑墅塾墨堕曼苎竺呈塑垫塑垦垄皇塾堡望望圣 堕主堂堡堡塞竺!，(方法： 1动物分组：健康无眼疾家兔16只。任选8只，随机分为两组，分别接受5mWcm23h和10mWcm23h的微波辐射，作GJIC功能测定。另8只分为两组，每组4只，经微波辐射后作Connexin43免疫荧光标记实验。实验均以自身另眼作正常对照。2标本制作及检测：取兔双眼晶体前囊膜，用5，6羟基荧光素乙酸乙酰盐(5，6-CFDA)染色作激光共聚焦显微镜细胞荧光淬灭及恢复情况测定。用免疫荧光标记Cx4
11、3作定位检测。结果： 1与正常眼对照，5mWcm23h和10mWcm23h的微波辐射后兔眼晶体上皮细胞荧光恢复速度明显减慢，GJIC功能破坏。两实验组组间比较差异有显著性，说明10mWcm2的微波辐射对GJIC功能的破坏作用更强。2Connexin43荧光标记定位结果显示：经低强度微波辐射后正常定位于晶体上皮细胞细胞膜上的Cx43发生了位移，并出现了数量上的变化。心结论：15mWcm2和10mWcm2的低强度微波通过抑制晶体上皮细胞间GJIC功能而影响晶体上皮细胞之间及上皮细胞与晶体纤维细胞之间的代谢协调与离子交换平衡，破坏晶体内稳态，激发和促使晶体上皮细胞的凋亡。2兔晶体上皮细胞GJIC功能
12、的改变与Connexin43数量的减少和正常功能定位状态的改变密切相关。6低强度撒渡辐射致免限量状体早期损伤及发生扎理的研究， 关键词： 微波辐射“ 晶体 上皮细胞。 凋亡超徽结构 透射电镜 流式细胞技术激光共聚焦显徽镜 间隙连接 连接蛋白Cx43堡塑曼塑茎堡墅墼墨堡曼苎堡呈塑塑塑墨垄兰垫堡塑坚塑 堕主兰堡!鎏!LTHE EARLY lRREVERSIBLE CHANGES IN RABBITSLENS EPITHELIAL CELLS lNDUCED BY LOWPOWER DENSITY MICROWAVE RADIATION ANDITS MECHANISMSMedical Instit
13、ute of Zhejiang University OphthalmologyPostgraduate Ye JuanSupervisor ProL Yao KeAbstractIt is well established that various factors can induce cataractformation including microwave radiationA resurgence of interest andconcern witll regard to the biologic effects and potential hazards of exposureto
14、 microwaves has been awokenSince the environmental exposure tomicrowave radiation usually belongs to low doses，until 1998 10mWcm2was recommended as the exposure limitIn 1998InternationalNonIonizing Radiation Committee(rNmc)developed guidelines forlimiting microwave exposure to eyes一5mWcm2Both of the
15、m are not thefinal exact health st蛐dardEven now,the exact nature of the biologicaleffects of microwave iS not completely elucidated and understoodand 1cadsto many answered questions：Whether exposure to microwave radiationunder the power densities of 10mWcm2 or 5mWcm2 iS really sare?Willthey cause th
16、e early irreversible damage to lens?What arc the mechanismsofthe effect ofthe lOW dose microwave radiationIn Our stlldy，rabbits were exposed to microwave radiation with the8低强度微波辐射致兔眼晶状体早期损伤及发生机理的研究 博士学位论文200power densities of 5mWcm2 and 10mWcmzWe tried to verify the safetyof limiting exposure guidelines and investigate the mechan
