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1、1不同灌注方法对深低温停循环下脑保护的实验研究作者：宋兵，任旭东，张巧燕，李元敏，程殿威，祁泉，朱德明【摘要 】 目的 探讨不同灌注方法在深低温停循环下(DHCA)的脑保护的作用。方法 实验动物选用健康白乳猪幼猪(农科院提供)40 只。随机分为 4 组，每组 10 只。A 组：单纯 DHCA 组; B 组：DHCA+逆行性脑灌注(RCP);C 组：DHCA+单侧顺行性脑灌注( U-SACP);D组：DHCA+ 双侧顺行性脑灌注 (B-SACP)。对照分析四组组间分别于 CPB 前(T1)、DHCA 后 30 min(T2)、60 min(T3)、90 min(T4)和复温再灌注 30 min(
2、T5)氧摄取率的变化。采用原位末端标记法(TUNEL 染色法)观察和测定脑组织神经细胞凋亡的情况。结果 与A 组相比，B 组、C 组和 D 组可显著减少幼猪 DHCA 后神经细胞凋亡数目(P0.05),T2 、T3 和 T4 3 个时间窗脑氧摄取率明显低于 A组，差异有显著意义(P0.05)。A 组可见明显神经细胞凋亡改变，B 组仅见中等程度神经细胞凋亡改变,C 组和 D 两组见少量神经细胞凋亡改变,A 组与 B 组,C 组和 D 组、B 组与 C 组和 D 组差异具统计学意义(P0.05)。结论 SACP 与 RCP 脑保护作用均优于 DHCA，U-SACP 与 B-SACP 脑保护作用好于
3、 RCP，但是两者差距没有统计学意义。 2【关键词】 深低温停循环; 顺行性脑灌注 ; 逆行性脑灌注;体外循环Abstract: OBJECTIVE To evaluate the protective effect of different perfusion during deep hypothermic circulatory arrest(DHCA). METHODS Fourty healthy baby pigs were randomly divided into four groups(10 pigs per group). Grouup A：simple DHCA, Grou
4、p B：DHCA+retrograde cerebral perfusion (RCP), Group C：DHCA+unilateral selective antegrade cerebral perfusion(U-SACP), Group D：DHCA+bilateral selective antegrade cerebral perfusion(B-SACP). Measure oxygen enhancement ratio(OER) from blood which were taken in different window around DHCA. Neural apopt
5、osis was identified by TUNEL in the brain. Comparely analysis the change of OER and the depression of neural apoptosis in the brain among four groups was performed. RESULTS OER levels were significantly difference at post DHCA 30 min(T2), 60min (T3), 90 min (T4) between group A and group B,C,D (P0.0
6、5). The number of neural apoptosic cells in group B,C,D were decreased significantly during DHCA (P0.05). The level of apoptosic cells in group B was much higher than that in group C and D(P0.05).CONCLUSION DHCA+RCP and DHCA+SACP are more both effective methods than DHCA on cerebral protection while
7、 the latter is more suitable. U-SACP and B-SACP are better than DHCA+RCP, but there was no difference between group C and D.Key words： Deep hypothermic circulatory arrest;Selective antegrade cerebral perfusion; Retrograde cerebral perfusion;Cardiopulmonary bypass 深低温停循环(deep hypothermic circulatory
8、arrest,DHCA)是婴幼儿复杂先天性心脏病的重要技术，它可以保护大脑承受短时的缺血、缺氧，提供一个无血的手术环境。虽然手术与监护水平有了较大的提高，DHCA 相关的脑损害仍时有发生 1。 探讨不同灌注方法在 DHCA时的脑保护的作用，成人病例在这方面做了大量工作，但是在儿童病例这种技术主要用于复杂先心病而非大动脉夹层等手术，因此，灌注方式又有所不同，本实验为后期研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与分组 实验动物选用白猪幼猪 (农科院提供)40 只，雌雄不限，体重 79 kg。按随机数字表法分为 4 组，每组 10 只。4A 组：单纯行 DHCA;B 组：DHCA+ 逆行脑灌注(
9、retrograde cerebral perfusion,RCP);C 组：DHCA+单侧顺行性脑灌注(unilateral selective antegrade cerebral perfusion,U-SACP); D组：DHCA+ 双侧顺行性脑灌注 (bilateral selective antegrade cerebral perfusion,B-SACP)。1.2 麻醉与监护 乳猪于术前 8 h 禁食，肌肉注射阿托品0.02 mg/kg，氯胺酮 20 mg/kg 麻醉诱导，硫喷妥钠 25 mg/kg耳缘静脉注射麻醉。气管内插管接呼吸机辅助呼吸，颈内静脉逆行穿刺并留置导管，用于抽
10、取血液标本。1.3 DHCA 实验模型建立 胸骨正中切口，全身肝素化。升主动脉与上下腔静脉插管，建立体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)， CPB 流量 80 ml/(kgmin)，常温转流 10 min 后开始降温，控制降温时间 20 min，降温至鼻咽温 18左右时停循环。A 组停循环 ,B 组按维持颈静脉压 2530 mmHg 的灌注量经上腔静脉行 RCP。C 组：无名动脉与左颈总动脉之间阻断，并阻断右锁骨下动脉，按 10 ml/(kgmin) 低流量行灌注。D 组：在左颈总动脉与左锁骨下动脉之间阻断血管，并阻断右锁骨下动脉，灌注两侧颈总动脉，流量 20 ml
11、/(kgmin)。停循环 90 min 后开放主动脉并复温，复温时间大于 30 min，鼻咽温 36时脱离 CPB。51.4 标本采集与检测1.4.1 血气分析和脑氧摄取率(oxygen enhancement ratio， OER) 各组分别于 CPB 降温前(T1)、停循环 30 min(T2)、60 min(T3)、90 min(T4)、复温再灌注 30 min(T5) 抽取颈静脉血1ml (RCP 时抽取主动脉返回血) 分别行血气分析检测, 测动脉与颈静脉血氧分压(PaO2，PjvO2) 、动脉与颈静脉血氧饱和度(SaO2，SjvO2) 及血红蛋白 (Hb)的值。计算 OER。OER=
12、(CaO2-CjvO2)/CaO2100%CaO2=(Hb1.36SaO2)+(0.003PaO2)CjvO2=(Hb1.36SjvO2)+(0.003PjvO2)1.4.2 海马以及皮层神经细胞的凋亡检测 四组动物术后 3 天，在麻醉状态下，经一侧颈总动脉插管灌注 37生理盐水，冲洗出血管内血液，直到静脉引流出的液体变清，4 4%多聚甲醛行颈总动脉灌注，迅速开颅取脑，取中间块放入相同固定液中继续固定 24 h。冠状切面切开猪脑，取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片，片厚 4 m，将石蜡切片常规脱蜡至水，用 TUNEL 法检测凋亡神经细胞。检测程序按试剂盒(由美国 CHEMICON 公司
13、生物公司提供)操作说明进行。TUNEL 图片结果采用 Axioplan 2 imaging 6医学显微图象分析系统进行图像分析。切片在光学显微镜高倍放大视野下随机选取脑皮层各 10 个视野，计数凋亡细胞数目和总细胞数，计算凋亡细胞指数(凋亡细胞指数=阳性细胞数/总细胞数100%) 。1.5 统计方法 统计学处理采用 SPSS 14.0 统计软件包，采用卡方检验，实验数据用均数标准差(s)表示，P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 大脑皮层以及海马区域神经细胞凋亡的检测 TUNEL 染色阳性细胞胞核中出现棕黄色颗粒。A 组脑组织损伤明显，可见大量凋亡的棕黄色颗粒即凋亡的神经细胞(见图
14、 1)。 B 组停循环同时逆行灌注后脑组织轻微损伤, 少量神经细胞变空, 多数为正常的神经细胞(见图 2)。C 组和 D 组停循环同时顺行灌注后脑组织基本正常, 神经细胞排列整齐，细胞密度大，核大而圆，核仁清晰，核膜光滑完整，细胞结构未见异常，大多数结构正常,少量空泡化(见图 3 和图4)。凋亡细胞计数及统计分析见表 1，结果显示，与 A 组相比，B组、C 组和 D 组神经细胞凋亡程度明显减少，差异具有统计学意义(P0.05)，B 组与 C 组和 D 组比较差异具统计学意义 (P0.05)。72.2 OER 结果显示 B 组与 C 组和 D 组在 T3、T4 和 T5 3 个时间窗 OER 明
15、显低于 A 组，差异有显著著意义(P0.05)，见表2。3 讨 论中枢神经系统的损伤是 DHCA 期间最严重的并发症， DHCA通过低温减少脑组织需氧量, 降低其代谢率，起到保护脑组织的作用，但是脑损害仍是制约 DHCA 主要因素1 。DHCA 后神经细胞发生凋亡、坏死导致神经元死亡，这个过程在停循环早期即开始，直至术后几天都存在，这是导致术后神经功表 1 海马与皮层凋亡细胞的比较表 2 OER 结果能障碍的一个主要原因。单纯 DHCA 安全时限有限 , 不能保护大脑耐受较长时间的缺血、缺氧。在此期间结合脑灌注脑保护是延长安全时限的好方法, 尤以 RCP 与 SACP 应用较为广泛。SACP
16、顺行性灌注脑部，优点在于符合生理、灌注时限较长。Di Eusanio 等2 临床报告，DHCA+SACP 技术是一种有效的 DHCA 脑保护方式。而且如果脑灌注时间超过 90min 并未增加病死率与神经功能障碍。Ueda 等3指出 SACP 尽管使大部分患者中枢神经系统功能得到好的保护，使用当前选择性脑灌注技术，脑中风的发生率仍然十分高。SACP 在理论上是最符合生理的。SACP 时大脑持续的血流能提供 DHCA 时8最佳的血流及代谢状态，维持脑部低温，提供代谢底物并带走代谢产物。上腔静脉 RCP 应用于 DHCA 脑保护已有 30 年历史，但是对此方法褒贬不一。Svensson 等4指出神经认
