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1、1不同序贯的西妥昔单抗与化疗药物联合对和- 细胞的增殖抑制作用【摘要 】 观察不同序贯的西妥昔单抗（）与化疗药物联合对人肝癌细胞系和-的增殖抑制作用，并分析其意义。 【方法】 浓度递增的和表柔比星、奥沙利铂、泰素、伊立替康四种化疗药物分别按照不同给药序贯联合作用于和-细胞，使用细胞计数试剂盒-检测不同给药序贯的药物对和-细胞的增殖抑制作用，利用生物学软件计算不同给药序贯时和化疗药物的半数抑制浓度（）的变化，计算其作用的协同系数（） 。 【结果】 和化疗药物联用对和-细胞的增殖抑制作用受给药序贯影响：先于化疗药物给药，两者的较单用时降低，但是值均大于，两者之间为拮抗效应；后于化疗药物给药，两者的
2、较单用时降低更为明显，且值均小于，两者之间具有较明显的协同效应。 【结论】 与化疗药物联用对肝癌细胞的增殖具有协同抑制作用，较佳的给药序贯是化疗药物先于2给药，能获得明显的协同效应，这有助于临床用药时降低药物剂量，减少毒副作用。 【关键词】 肝肿瘤 西妥昔单抗 联合化疗 表皮生长因子受体： 【 】 - ， ， 【】 （ ） （ ） ， （ ） ， 3（ ） （ ） - ， - - ， 【】 - ， 4 ， ， ， ， 【】 - ， 5 ： ； ； ； 原发性肝癌起病隐匿，出现症状后进展迅速，患者就诊时多已届晚期失去手术根治机会，其总体年生存率不足。对于局部进展（肝内播散或门静脉癌栓）或合并远处
3、转移的晚期肝癌尚缺乏有效的治疗手段 。传统的全身化疗效果不理想，虽然所有上市的化疗药物都曾经试用于肝癌的治疗，但是客观缓解率最多不超过。加之传统的化疗药物往往具有选择性差，毒性大等缺点，更限制了在肝癌患者中的应用 。随着对各种细胞表面分子与恶性肿瘤发生发展关系的研究不断深入，研究者发现表皮生长因子受体（ ，）在许多肿瘤细胞中，如肺癌、结肠癌、头颈部鳞癌等的细胞表面能检测到异常的高表达，并常与恶性肿瘤的预后不良、早期复发转移、化疗抗拒等直接相关- 。西妥昔单抗（）是新近开发的靶向的单克隆抗体，在多种恶性肿瘤如头颈部鳞癌、结直肠癌等的治疗中，单用或与传统化疗方案联合，取得了令人鼓舞的效果- 。已有
4、研究提示肝癌组织和癌旁肝组织中存在6的高表达， ，提示及其信号通路在肝癌的发生发展中可能具有重要的作用。目前国内外对于靶向药物与化疗药物联合用于治疗肝癌的报道极少，本研究通过观察与化疗药物的不同给药序贯对人肝癌细胞系和-的增殖抑制作用，探讨其对肝癌细胞的化疗增敏效果与给药序贯的关系，为寻找优化的治疗序贯并进一步运用于肝癌患者的临床治疗提供实验依据。 材料与方法 药品与试剂西妥昔单抗（）购自德国默克公司，表柔比星（）购自美国辉瑞公司，奥沙利铂（）购自法国赛诺菲安万特公司，泰素（）购自美国施贵宝公司，伊立替康（）购自英国安万特公司，-细胞计数试剂盒（ -）购自日本同仁化学研究所， 培养液、 新生小
5、牛血清、含 青霉素和 链霉素的双抗、 胰酶溶液购自美国公司。为 的溶液，泰7素为 的溶液，表柔比星、奥沙利铂、伊立替康为粉剂，以上药物均使用为的溶液稀释至目标浓度。 细胞株及培养方法人肝癌细胞株，-由中山大学肿瘤防治中心实验研究部提供。细胞培养于含 新生小牛血清、 青霉素和 链霉素的-培养液中，置于 、分压为（体积百分数） 、湿度的恒温培养箱中培养，每 传代次，取对数生长期细胞进行实验。 体外- 细胞增殖抑制实验 细胞接种取对数生长期的和-细胞，经 胰酶溶液充分消化后分别使用含 新生小牛血清、 青霉素和 链霉素的-培养液稀释成单细胞悬液，细胞密度为 个，-细胞密度为 个，接种于孔培养板，接种过
6、程细胞悬液保持吹8打和晃动使细胞分布尽量均匀。每孔加入细胞悬液 ，使每孔中细胞为 个， -细胞为 个，空白对照孔加入 不含小牛血清的培养液，置于 、体积分数的、湿度的恒温培养箱中培养 ，使细胞贴壁生长后，更换新培养基。 药物分组及加药方法实验设空白对照组、细胞对照组、单药处理组（、表柔比星、奥沙利铂、泰素、伊立替康） ；序贯处理组按照不同加药序贯，又分为序贯处理组（化疗药物组）和序贯处理组（化疗药物组） ，每组中每一药物浓度各设个复孔。空白对照组在铺孔时用 培养液代替细胞悬液，细胞对照组和药物处理组铺孔时加入 的细胞悬液，经 细胞贴壁后，更换新培养液。加药时空白对照组加入 培养液；细胞对照组加
7、入 培养液 的溶液（ ） ，单药处理组加入 培养液、 药物溶液，使每孔中液体终体积为 ；序贯处理组先加入 培养液和 的溶液，培养 后，小心倒出培养板内液体，9每孔内加入 的溶液轻微振荡洗去残留于孔壁的药物，重复次，加入 培养液和 的化疗药物，继续培养 ；序贯处理组先加入 培养液和 的化疗药物培养 ，照前法洗涤培养板去除残留药物后，加入 培养液和 的，继续培养 。实验药物单用时选取个依次递增的浓度处理细胞，浓度分别为（ ） ，表柔比星（ ） 、奥沙利铂（ ） 、泰素（ ） 、伊立替康（ ） ；序贯处理时，加入孔内的两药浓度亦同时递增，其浓度比例保持恒定。 实验方法单药处理组经 、化疗药物 作用后，序贯处理组按照不同序贯的 和化疗药物 作用后，于培养板每孔内加入 的-溶液， 下孵育 ，全自动酶标仪以 和 双波长测定各孔吸光度（值） ，实验重复进行次，取次计算所得抑制率的均数输入软件计算结果。10 计算方法各组细胞存活率（）（该药物处理组值空白对照组值）（细胞对照组值空白对照组值）；细胞增殖抑制率（）该组细胞存活率；统计学处理根据等药物协同作用
