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1、1三氧化二砷对胆囊癌细胞化疗增敏作用及其机制研究【摘要】 目的 探讨三氧化二砷（As2O3）对人胆囊癌 GBC 细胞化疗增敏作用及其机制。方法 用流式细胞仪检测 As2O3 联合 5氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素作用下胆囊癌细胞凋亡情况。用Western blot 分析凋亡相关蛋白 Bcl-2、Caspase-3 和 PARP 的表达。结果 在 As2O3 的协同作用下，5氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素对胆囊癌 GBC 细胞的诱导凋亡作用得到增强；蛋白水平的检测表明 Caspase-3 和 PARP 的剪切上升，而 Bcl-2 的蛋白表达下降。结论 As2O3 具备对胆囊癌细胞化疗增敏潜能，并主要通过
2、改变Caspase-3、PARP 及 Bcl-2 等的表达来实现。 【关键词】 三氧化二砷；胆囊癌细胞；化疗；细胞凋亡Enhanced effect of Arsenic trioxide on chemotherapy of gallbladder carcinoma and its mechanism Abstract Objective To study the enhanced effect of As2O3 on the chemotherapy of gallbladder carcinoma cell and its mechanism.Methods Flow cytometr
3、ic was used to determine the apoptosis of GBC cells conducted by As2O3 2combined with 5-Fu,Mitomycin and Adriamycin.Western blot was performed to analysis apoptotic proteins expression of Caspase-3,PARP and Bcl-2.Results The apoptotic activity of 5-Fu,Mitomycin and Adriamycin were enhanced by As2O3.
4、The proteins expression of Caspase-3,PARP were up-regulated,howere, that of Bcl-2 was down-regulated.Conclusion As2O3 could play a potential role to the chemotherapy of gallbladder carcinoma via up- or down- regulation of the expression of apoptotic relevant protein. Key words arsenic trioxide;gallb
5、ladder carcinoma cells;chemotherapy;apoptosis胆囊癌约占腹部恶性肿瘤的第 5 位，由于缺乏特异性的临床表现，早期诊断困难，待确诊时多属晚期，手术切除率较低。常规化疗药物对胆囊癌的效果较差，需要寻找治疗胆囊癌新的有效药物。三氧化二砷（As2O3）在治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突破性成果1 ，国内外的研究也发现， As2O3 可诱导多种肿瘤细胞、包括胆囊癌细胞的凋亡24 。本研究探讨 As2O3 对人胆囊癌 GBC细胞化疗增敏作用，并对相关机制做初步研究。1 材料和方法31.1 细胞和主要试剂 As2O3 购自 Sigma 公司，用生理盐水 1 mmo
6、l/L 的储存液，使用前用完全培养基稀释到所需浓度。抗 Cleaved-Caspase-3、Bcl-2 和 PARP 等的抗体购自 Cell Signal。抗 GAPDH 的抗体购自 Santa Cruz Biotechnology。抗 HA 的抗体购自 Roche Applied Science。人胆囊癌细胞 GBC 购自中科院细胞所。发光试剂购自 Amersham Pharmacia Biotech。1.2 细胞培养 GBC 细胞接种在含 10小牛血清的 DMEM 培养液中，在温度 37、5CO2 的培养箱中。取对数生长期的细胞，接种在含 10小牛血清的 DMEM 培养液中，每孔 2105
7、 接种于96 孔板、温度 37 、5CO2 的培养箱中。24 h 后分别加入 5-氟尿嘧啶（50 mmol/L） 、阿霉素（10 mmol/L） 、丝裂霉素（4 mol/L）及 1 mmol/L As2O3 连续培养 24 h，检测细胞凋亡情况。1.3 流式细胞仪检测 收集 1107 个细胞，800 g 离心 10 min，0.01 mmol/L PBS 洗涤 1 次，用 70冷乙醇固定 18 h，再用 PBS 洗去固定液，加碘化丙啶染色液 1 4ml（20 g/ml PI）,终浓度为 50 mg/ml，置入 4 冰箱 30 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡。1.4 Western Blot
8、分析 提取细胞总蛋白， BCA Protein Assay Kit 定量，80 g 蛋白用 10SDS-PAGE 分离，转膜，封闭后。加入一抗，二抗，并显色。2 结果2.1 As2O3 诱导对胆囊癌 GBC 细胞的化疗增敏作用 胆囊癌GBC 细胞培养 24 h 后分别加入 5-氟尿嘧啶（50 mmol/L） 、阿霉素（10 mmol/L） 、丝裂霉素（ 4 mol/L）及 1 mmol/L As2O3，连续培养 24 h 后检测细胞凋亡发现：As2O3 作用下胆囊癌细胞凋亡率明显上升，同时，在 As2O3 的协同作用下，各化疗药对胆囊癌细胞的诱导凋亡作用明显增强，As2O3 增强了每种化疗药物
9、对胆囊癌细胞的诱导凋亡作用（见图 1） 。2.2 Western Blot 检测相关蛋白 与未用 As2O3 相比较，细胞凋亡通路中的重要因子 Caspase-3 和 PARP 的剪切明显增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的蛋白表达明显受抑（见图 2） 。3 讨论 5近年来，As2O3 在实体瘤治疗的研究中颇受关注，并在原发性肝癌的基础和临床研究中取得了成功，2005 年中国食品和药品监督管理局已将原发性肝癌批准为 As2O3 临床治疗的适应证。我们此前的研究显示 As2O3 能抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的生长5 、诱导人胆囊癌 GBC 细胞的凋亡6 ，本研究探讨 As2O3 对人胆囊癌GBC 细胞
10、化疗增敏作用及机制。细胞凋亡或程序化细胞死亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程，其在肿瘤的发生发展和肿瘤治疗中起着重要作用，也是众多抗癌药物的主要作用环节。本研究结果显示，As2O3 增强了 5-氟尿嘧啶、阿霉素及丝裂霉素这三种传统化疗药物对胆囊癌细胞的诱导凋亡作用，说明As2O3 具有对胆囊癌的化疗增敏作用。Caspase-3、PARP 和 Bcl-2 在细胞凋亡过程中扮演了重要的角色。实验结果显示：在 As2O3 协同作用下，Caspase-3 和 PARP的剪切明显增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的蛋白表达明显受抑。Caspase-3 和 PARP
11、 的剪切增加、Bcl-2 的表达下降，从两方面使得各传统化疗药对胆囊癌细胞的诱导凋亡作用得到增强。综上所述，As2O3 具备对人胆囊癌 GBC 细胞化疗增敏潜能，这为将 As2O3 应用于胆囊癌的临床综合治疗提供了理论依据。6【参考文献】1 张鹏,王树叶, 胡龙虎,等. 三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病七年总结-附 242 例分析. 中华血液学杂志,2000,21（2）:67-70.2 Uslu R,Sanli UA,Sezgin C,et al.Arsenic trioxide-mediated cytotoxicity and apoptosis in prostate and ovar
12、ian carcinoma cell lines.Clin Cancer Res,2000,6 （12 ） :4957-4964.3 Shen ZY,Shen J,Cai WJ,et al.The alteration of mitochondria is an early event of arsenic trioxide induced apoptosis in esophageal carcinoma cells.Int J Mol Med,2000,5 （2） :155-158.4 艾志龙,陆维琪,秦新裕.三氧化二砷诱导人胆囊癌 GBC 细胞凋亡及其机制研究.中国癌症杂志,2006,16（5） :379-382.5 艾志龙,童赛雄,陆维琪,等. 三氧化二砷抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤生长及促凋亡作用.中国癌症杂志,2007,17（9）:689-691.6 Ai Zhilong,Lu Weiqi,Qin Xinyu.Arsenic trioxide induce gallbladder carcinoma cell apoptosis via downregulation of 7Bcl-2.BBRC,2006,8（348）:1075-1081.
