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1、1VEGF、LN 和 FN 在大肠癌组织中的表达及临床意义【关键词】 VEGF【摘要】 目的 选择血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF） 、层粘蛋白（Laminin，LN）和纤维连接蛋白（Fibronectin ，FN）在大肠癌组织中的表达，探讨它们与大肠癌生物学行为的关系以及对大肠癌患者生存率的影响。方法 选择正常大肠组织 10 例，大肠癌 70 例。用美国 Santa Gruz公司产的 VEGF 单克隆抗体和 LN、FN 的单克隆抗体，采用免疫组化 SP 法检测正常大肠组织和大肠癌组织中的 VEGF、LN 和 FN 的表达。VEG
2、F、LN、FN 在不同 Dukes 分期和癌细胞分化程度中的表达差异用 2 检验，对大肠癌生存率的影响用时序检验（Log-rank）检验。结果 VEGF 免疫染色位于癌细胞的细胞质内，正常大肠粘膜中表达阴性。70 例大肠癌组织中， 47 例 VEGF 免疫染色阳性。VEGF 表达随 DukesA-G 增加而增加，并随分化程度下降而增高。VEGF 表达与 Dukes 分期、癌细胞分化程度是一致的（P0.01，P0.05） 。生存资料分析表明 VEGF 阳性者生存率低于 VEGF 阴性者，VEGF 表达对大肠癌患者的生存率有非常显著性影响（P0.01） 。正常大肠粘膜有完整的基底膜，LN 和 FN
3、 强表达，间质中 FN 广泛表达。大肠癌组织基底膜中 LN 和 FN 有不同2程度的减少，甚至完全缺失。间质中 FN 表达无明显变化。LN 与FN 在大肠癌组织中的表达与癌细胞分化程度一致（P0.01，P0.05） 。LN 表达随 Dukes 分期增高而减少（P0.05） 。生存资料显示基底膜中 LN 的表达对大肠癌患者生存率有显著影响，而 FN 表达与大肠癌患者的生存率无明显相关。结论 VEGF 作为一种特异性的促血管生成因子，在大肠癌的发生发展和自然病程中起重要作用，随 Dukes 分期的增高和癌细胞分化程度的降低其表达增加并影响患者的生存率;基底膜中 LN 和 FN 的表达随大肠癌细胞分
4、化程度降低而减少，基底膜中 LN 的表达与Dukes 分期相关，且影响患者术后生存率。检测大肠癌组织中VEGF 和 LN 的表达有利于指导治疗和判断预后。关键词 大肠癌 血管内皮生长因子 层粘蛋白 纤维连接蛋白 免疫组化 The expression of VEGF、LN and FN in colorectal cancer and their clinical implications 【Abstract】 Objective To study the role of vascular endothelial growth factor（VEGF） ，laminin（LN）and fibr
5、onectin（FN）in the biological behavior and survival in 3colorectal cancer.Methods 10normal colorectal mucosa and70colorectal cancer cases were examined.The expression of VEGF，LN and FN was examined in normal colorectal mucosa and colorectal cancer，using the monoclonal antibodies（produced by Santa Cru
6、z，USA） ，with SP immunoperoxidase technique.Correlation between VEGF，LN，FN and the Dukes stage，degree of tumor differentiation was examined by chi-squre test。The prognostic value of VEGF，LN and FN expression in colorectal cancer was analyzed by using log-rank test.Results The VEGF immunostaining was
7、localized in the cytoplasma of cancer cells.No reactivity was observed in normal mucosa.The frequency of VEGF expression in70cases of colorectal cancer was67.1%，corresponding with Dukes stage and degree of differentiation.Analysis of survival data showed that the expression of VEGF had a significant
8、 effect on survival，in other words，the survival rate in VEGF positive group was lower than negative group.The normal colorectal tissue had a continuous basement membrane and strong expression for LN and FN，stromal FN was expressed in all the normal mucosa。The expression of LN and FN in basement memb
9、rane was decreased in colorectal cancer and 4was correlated with grade of tumor differentiation and LNwas correlated with Dukes stage，but the expression of stroma FN was not different from that in the normal mucosa.Extensive LN expression in basement membrane had better survival than cases with limi
10、ted LN expression（P0.05）.Conclusion VEGF as a special angiogenesis factor，plays an important role in the occurece，development and natural course of colorectal cancer.The expression of LN in basement memberane is correlated with Dukes stare and differential grade and has an effect on survival.The exp
11、ression of VEGF and LN in colorectal cancerwere helpful for clinicians to define prognosis and select appropriate type of therapy for the patients.Key words colorectal cancer vascular endothelial growth factor laminin fibrorlectin immuno-histochemistry 大肠癌是最常见的肿瘤之一，而且其发病率呈上升趋势。大肠癌广泛浸润和远处转移是造成大肠癌死亡的主
12、要原因。现代分子生物学研究表明大肠癌的浸润和转移有其复杂的分子生物学基础。5本课题选择血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF） 、层粘蛋白（Laminin，LN）和纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）在大肠癌组织中的表达，笔者所取的 70 例大肠癌标本均为我院肿瘤外科 1994 年 1 月1995 年 12 月间行大肠癌根治性手术切除的标本，经病理证实为大肠癌，另取正常大肠组织 10 例作为对照，以探讨它们与大肠癌生物学行为的关系以及对大肠癌患者生存率的影响。1 资料与方法1.1 临床资料 70 例大肠癌标本均为 81 医院肿瘤
13、外科 1994年 1 月1995 年 12 月间行大肠癌根治性手术切除的标本，经病理证实为大肠癌，其中男 39 例，女 31 例，年龄 2570 岁，平均年龄（54.513.2）岁。术前未经过任何化疗和放疗。标本均经福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，5m 连续切片， HE 染色。另取正常大肠组织 10 例作为对照。1.2 免疫组化染色 VEGF 单克隆抗体为 Santa Cruz 公司产品，免疫组化采用 SP 法，SP 试剂盒为 Maxim 公司产品（购自福建迈新生物公司） 。染色步骤:（1）连续切片，片厚 5m;（2）二甲苯脱蜡 3 次，每次 15min，逐级酒精下行至水化;（3）1%H 2
14、 O 2 15min 灭活内源性过氧化物酶 ;（4 ）PBS 洗 3 次，每次65min;（5 ）置 0.05%胰蛋白酶液 37消化 30min;（6）PBS 洗 3次，每次 5min;（7）滴加 10%正常山羊血清 15min 抑制非特异性结合; （ 8）滴加一抗，4 过夜; （9 ）PBS 洗 3 次，每次5min;（10）滴加二抗（生物素化兔抗鼠 IgG）;37孵育30min;（11）PBS 洗 3 次，每次 5min;（12 ）滴加复合物（链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液） ，37 孵育 30min;（13）DAB 显色液镜下显色;（14）苏木素复染，透明封片以 PBS 缓冲液代替一抗
15、做阴性对照。1.3 阳性判断 以细胞核、细胞质或细胞膜呈清晰棕色为阳性，VEGF 染色按阳性细胞比例小于 25%计为阴性，大于 25%计为阳性。1.4 统计学方法 用 2 检验比较 VEGF 在各组大肠癌中的表达，用时序检验（Log-Rank 检验）检测 VEGF 的表达与术后生存率的关系，并绘出生存率曲线（Kaplan-Meier 曲线）统计工作在 SPSS8.0 分析软件上完成。2 结果所有正常肠粘膜都有完整的基底膜，LN 和 FN 染色阳性且完整，包绕整个腺体，间质中 FN 广泛着色。70 例大肠癌组织的基底7膜中，LN 阴性者 21 例，LN 弱阳性者 28 例，LN 强阳性者 21 例;FN 阴性者 14 例，弱阳性者 32 例，强阳性者 24 例。基底膜中 LN和 FN 染色与大肠癌的 Dukes 分期和分化程度的关系，见表 1。表 1 基底膜中 LN 和 FN 染色和大肠癌临床病理因素的关系 （略）注: 在不同 Dukes 期中，LN 的表达差异有非常显著性，P0.05;LN 在不同分化的大肠癌中表达差异有显著性，P0.05;在不同分化的大肠癌中 FN 表达差异有显著性，P0.05。DukesA 期中 LN（-）2 例，LN（+）2 例，LN （+）8 例，DukesB 期中LN（-）5 例，LN（+）9 例，LN （+
