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1、1RNA 结合蛋白 Sam68 mRNA 在原发性肝癌中的表达及意义作者：马高祥 傅利锋 王涌 吴育连 【摘要 】 目的 探讨 RNA 结合蛋白 Sam68 mRNA 在人原发性肝癌组织中的表达及意义。方法 选取 20 例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织，采用 TRIzol 一步法提取总 RNA，采用 RT-PCR法检测 Sam68 mRNA 在肝癌组织及相应癌旁组织中的表达。 结果 PCR 产物电泳显示肝癌组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为60.719.26 ，相应癌旁组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为76.9811.61，经配对 t 检验，P0.05 ，具有统计学差异
2、。 结论 与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中 Sam68 mRNA 的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中 Sam68 的表达在转录水平受到明显抑制。 【关键词】 肝癌 RNA 结合蛋白 聚合酶链反应【Abstract】Objective To discuss the expression of sam68 in primary heptocarcinoma ant its significance. Methods 20 cases of tumor tissues and corresponding near-2tumor tissues of human primary hepat
3、ocellular carcinoma were collected. Total RNA was extracted from specimens using TRIzol one-step method, the expression level of sam68 in both of tumor tissues and corresponding near-tumor tissues were observed with reverse tranctiption-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Examined by ultravi
4、olet spectrophotometer, the mean expression level of sam68 was 60.719.26 in tumor tissues, and 76.9811.61 in near-tumor tissues. By match data test, P0.05, indicated the difference had statistic significance. Conclusion Comparing to responding near-tumor tissues, the amounts of sam68 mRNA expression
5、 were lower in human primary hepatocellular carcinoma. It shows that the expression of RNA-binding protein sam68 is inhibited at transcription level in human hepatocellular carcinoma.【Key word】hepatocellular carcinoma RNA-binding protein polymerase chain reaction(PCR)Sam68 是 STAR 蛋白家族的代表成员之一, 目前关于Sa
6、m68 的报道仅限于国外研究，且大多以序列结构分析及相关配体检测为主，而 Sam68 与各种恶性肿瘤的相关性研究较少，在原发3性肝癌中的表达情况国内外少见正式报道。本研究通过半定量 RT-PCR 技术，首次明确了 RNA 结合蛋白Sam68 mRNA 在人原发性肝癌中的表达情况，为进一步研究 STAR蛋白在肿瘤形成和发展过程中的作用机制提供了一定的理论基础。1 材料和方法1.1 材料20 例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织取自浙江大学医学院附属二院病理科新鲜冰冻标本,主要试剂 TRIZOL （Invitrogen公司）MMLV （逆转录酶）和 Taq DNA polymerase （Prom
7、ega公司）dNTP（上海博亚生物技术公司） ，DEPC （GIBCO 公司） Agarose （AMRESCO 公司）DNA Marker DIL2000（Takara 公司） 乙醇、氯仿、异丙醇、溴化乙锭及其他试剂均为国产或进口纯试剂。1.2 方法(1)细胞总 RNA 提取（RNA extraction）取 20 例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织分成 20 对样本，碾磨成粉 ,采用4TRIzol 一步法提取总 RNA。(2)RNA 质量检测 取 RNA 2l，加98l DEPC 水，混匀，紫外分光光度仪比色测 OD 值，计算A260/280 比值，以及所抽提的总 RNA 浓度(3)RT
8、-PCR 法检测Sam68 的表达 参照国外文献设计 Sam68 及 -actin引物各一对，(引物序列见表 1，由上海生工生物技术工程服务有限公司合成。)PCR 扩增产物片段分别为 Sam68 530bp，-actin 300bp。 取各样本组 RNA 行常规 RT-PCR 扩增，RT 参数设置按照说明书，PCR 参数设置如下：94预变性 5min；94变性 30s，55退火 45s，70延伸 1min，Sam68 和 -actin分管扩增，均为 35循环；再 72最终延伸 10min，PCR 产物 4保存并测序(交由生物公司代为测序)。取 10l PCR 扩增产物，以 1.8琼脂糖凝胶电泳
9、，图像扫描保存，用 Band Leader（Ver3.00）电泳图像分析软件，对电泳条带的光密度进行分析，以 CAR/-actin的光密度比值作为相对定量，表示 Sam68 mRNA 的表达强度。表 1 PCR 引物序列（略）1.3 统计学分析每个样本重复 3 次 PCR，取 Sam68/-actin的光密度比值的均值为统计数据。以 SPSS 11.5 统计学软件进行分析，采用配对5资料 t 检验。P0.05 为差异有显著性意义。2 结果对总 RNA 用紫外分光光度计进行检测， A260/A2801.8，证明提取的总 RNA 纯度较高，无蛋白质污染。经 DNA 测序，PCR 产物序列与 Sam
10、68 基因序列完全吻合，证实为 Sam68 基因扩增产物。PCR 产物电泳显示(见图 2,图 3)本组 20 例，除 2 例呈阴性外，其余 18 例肝癌及相应癌旁组织均检出 Sam68 mRNA 表达。其中，肝癌组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为 60.719.26，相应癌旁组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为 76.9811.61，经配对 t 检验，P 0.05，具有统计学差异。3 讨论Sam68 作为 STAR 蛋白家族的代表成员之一，是 20 世纪末新发现的一种 RNA 结合蛋白。 Courtneidge 和 shalloway 通过研究发现该 RNA 结合蛋白的分子量
11、是 68Kda，在有丝分裂过程中是 Src的底物，因此将其命名为 Sam68， 。Sam68 主要定位于核内,最新研究显示，Sam68 与肿瘤形成密切相关。Liu 等通过随机纯合子敲除法，用逆转录病毒为介导将反义RNA 导入鼠纤维母细胞系 NIH3T3，产生一种染色体基因失活的特6殊表型。检测显示，该特殊表型的 NIH3T3 细胞所表达的 Sam68水平不到野生型的 25%，同时这些细胞的软琼脂集落形成率大大增加，表现出非锚着依赖性生长，缺乏细胞接触抑制，并能够在裸鼠中形成转移性肿瘤。若将 Sam68 表达水平从 25人为提高到野生型的 50左右，可逆转部分细胞的肿瘤化生长状态，但这种逆转是不
12、彻底的。上述研究提示 Sam68 可能是一种肿瘤抑制剂。本研究采用半定量 RT-PCR 技术，首次对人原发性肝癌及相应癌旁组织中 Sam68 mRNA 的表达情况进行了检测。结果显示，肝癌组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为(60.719.26)，相应癌旁组织中 Sam68 mRNA 平均表达强度为 (76.9811.61)，经配对 t 检验，两组差别有统计学意义。从而表明与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中 Sam68 mRNA 的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中 Sam68 的表达在转录水平受到明显抑制。这一结果与国外研究一致 。值得一提的是，本组中有 2 例样本，无论是肝
13、癌组织还是相应癌旁组织，均未检测到 Sam68 mRNA 的表达，推测癌旁组织可能存在 Sam68 基因缺失突变，或处于癌前期病变（2 例均存在明显肝硬化） ，Sam68 mRNA 表达已经明显受抑，因样本量较少，无法得出结论。尽管有研究表明 Sam68 在细胞增殖，分化和肿瘤形成过程中发挥重要作用，但确切的生物学机制尚不清楚，其在肿瘤发生发展过7程中到底扮演何种角色等问题，均有待于进一步的深入研究。与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中 Sam68 mRNA 的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中 Sam68 的表达在转录水平受到明显抑制。【参考文献】1 J Kool, V W， Zann
14、e C. Terleth. Down-regulation of T-STAR, a growth inhibitory protein, after SV40-mediated immortalization. Cell Growth Differ, 2001, 12: 535541.2 M F Moran, CA Koch, D Anderson, et al. Src homology region 2 domains direct protein-protein interactions in signal transduction. Proc. Natl. Acad.Sci. U.
15、S. A, 1990, 87: 862286263 S Fumagalli, NF Totty, JJ Hsuan, et al. A target for Src in mitosis. Nature, 1994, 368: 871874.4 A Weng, SM Thomas, RJ Rickles, et al. Identification of Src, Fyn, and Lyn SH3-binding proteins: implications for a function of SH3 domains. Mol. Cell. Biol, 1994,14: 45094521.85
16、 C.Y. Liu, A. Flesken-Nikitin, S. Li, et al. Inactivation of the mouse Brca1 gene leads to failure in the morphogenesis of the egg cylinder in early postimplantation development. Genes Dev, 1996, 10: 18351843.6 K Liu, L Li, PE Nisson, et al. Neoplastic transformation and tumorigenesis associated with sam68 protein deficiency in cultured murine fibroblasts. J. Biol. Chem, 2000, 275: 40
