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1、人源化抗体分子研究进展【摘要】抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体和表 面 重 塑 抗 体 逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。 【关键词】 嵌合抗体；人源化抗体；人源化抗体的制备目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody,HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，
2、减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点 1。人源化抗体 humanized antibody 又称为互补决定区移植抗体，即将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所致的人抗鼠抗体反应 2。1.人源化抗体的分类 3，41.1 嵌合抗体(Chimeric antibody)嵌 合 抗 体 是 利 用 DNA 重 组 技 术 ， 将 异 源 单 抗 的 轻 、 重 链 可 变 区 基 因 插 入含 有 人 抗 体 恒 定 区 的 表 达 载 体 中 ， 转 化 哺 乳 动 物 细 胞 表 达 出 嵌 合 抗 体 ， 这 样表 达
3、的 抗 体 分 子 中 轻 重 链 的 V 区 是 异 源 的 ， 而 C 区 是 人 源 的 ， 这 样 整 个 抗 体分 子 的 近 2/3 部 分 都 是 人 源 的 。 这 样 产 生 的 抗 体 ， 减 少 了 异 源 性 抗 体 的 免 疫原 性 ， 同 时 保 留 了 亲 本 抗 体 特 异 性 结 合 抗 原 的 能 力 。20世纪80 年代中期开始研制的第一代人源化抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源单抗的恒定区 5。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。美罗华(Rituximab)作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体，就是
4、由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区(V)约占整个抗体的30，鼠源性抗体V区中的框架区(FR)仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA 反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差异，这类嵌合抗体不需要作任何改变，而不致发生抗体反应。1.2 改型抗体改 型 抗 体 (Reshaped Ab)也 称 CDR 植 入 抗 体 (CDRgraftingantibody)， 抗 体 可变 区 的 CDR 是 抗 体 识 别 和 结 合 抗 原 的 区 域 ， 直 接 决 定 抗 体 的 特 异 性 。 将 鼠 源单 抗 的 CDR
5、 移 植 至 人 源 抗 体 可 变 区 ， 替 代 人 源 抗 体 CDR， 使 人 源 抗 体 获 得 鼠源 单 抗 的 抗 原 结 合 特 异 性 ， 同 时 减 少 其 异 源 性 。 然 而 ， 抗 原 虽 然 主 要 和 抗 体的 CDR 接 触 ， 但 FR 区 也 常 参 作 用 ， 影 响 CDR 的 空 间 构 型 。 因 此 换 成 人 源 FR区 后 ， 这 种 鼠 源 CDR 和 人 源 FR 相 嵌 的 V 区 ， 可 能 改 变 了 单 抗 原 有 的 CDR 构型 ， 结 合 抗 原 的 能 力 会 下 降 甚 至 明 显 下 降 。 虽 然 目 前 已 能 对
6、 抗 体 进 行 分 子 设计 ， 在 人 源 FR 区 引 入 鼠 源 FR 区 的 某 些 关 键 残 基 ， 如 配 置 得 当 ， 其 亲 和 力 可与 原 有 小 鼠 抗 体 的 亲 和 力 相 当 ， 但 人 化 抗 体 常 达 不 到 原 有 鼠 源 单 抗 的 亲 和 力 。总之，CDR移植抗体或改型抗体是更为完全的人源化抗体，即真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的外，其余全部是人源结构。如国家I类癌症治疗新药 “泰欣生”，即“泰欣生重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体” ，采用了先进的“CDR 移植”技术，人源化程度达到95以上，具有更高的安
7、全性和更低的毒性。1.3表 面 重 塑 抗 体表 面 重 塑 抗 体 是 指 对 异 源 抗 体 表 面 氨 基 酸 残 基 进 行 人 源 化 改 造 。 该 方 法的 原 则 是 仅 替 换 与 人 抗 体 SAR 差 别 明 显 的 区 域 ， 在 维 持 抗 体 活 性 并 兼 顾 减 少异 源 性 基 础 上 选 用 与 人 抗 体 表 面 残 基 相 似 的 氨 基 酸 替 换 ； 另 外 ， 所 替 换 的 区段 不 应 过 多 ， 对 于 影 响 侧 链 大 小 、 电 荷 、 疏 水 性 ， 或 可 能 形 成 氢 键 从 而 影 响到 抗 体 互 补 决 定 区 （ CDR
8、） 构 象 的 残 基 尽 量 不 替 换 。1.4 全 人 源 化 抗 体 (Fully humaneantibody)6全 人 源 化 抗 体 是 指 将 人 类 抗 体 基 因 通 过 转 基 因 或 转 染 色 体 技 术 ， 将 人 类编 码 抗 体 的 基 因 全 部 转 移 至 基 因 工 程 改 造 的 抗 体 基 因 缺 失 动 物 中 ， 使 动 物 表达 人 类 抗 体 ， 达 到 抗 体 全 人 源 化 的 目 的 。 目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因技术，这 2 种制备技术竞争至今，孰优孰劣尚未可知 7。2 人源化抗体的制备2.1噬菌体抗体库技术
9、噬菌体抗体库技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线，为人源化抗体的制备提供了新途径。噬菌体抗体库( phage antibody library) 技术是20 世纪 90 年代初期抗体工程领域的重大研究进展，它结合了噬菌体展示与抗体组合文库技术，把外源的DNA 插入噬菌体编码的外壳蛋白 p或p的基因中，使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌体库的产生、结合抗原的展示抗体的筛选、展示有高亲和力抗体的噬菌体扩增、有高亲和力的抗体的分离和定性的具体步骤 8。其基本方法是从人外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA 或基因组 DNA，设计核苷酸引物，用
10、PCR方法克隆人全套抗体重链及轻链可变区基因组装到噬菌体表达载体内，与噬菌体外壳蛋白基因融合，感染大肠杆菌并使抗体片段表达于噬菌体。然后利用抗原抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆性扩增，获得可溶性抗体片段(如Fab、scFV及dsFv 等) ，即噬菌体抗体 9。1989 年美国Scripps 研究所Lerner 实验室首次应用噬菌体表面展示技术构建了噬菌体抗体库 10。该技术在制备基因工程抗体方面发展迅速，国内外已有人源或鼠源抗HBV、HIV 、RSV、TNF、erbB2、gp120 等噬菌体抗体的报道。侯佩强 8等利用该技术成功构建了大肠癌噬菌体抗体库和鼻咽癌抗独特型抗体库，并从
11、中筛选出全人源抗大肠癌单链抗体和鼻咽癌抗独特型单链抗体。2.2 转基因技术全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫方法获得 7，10 。产生一免疫反应的基因工程敲除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活内源性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就可以在小鼠体内产生全人抗体分子。另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠体内细胞，转染色体小鼠的免疫抗原基因环境和人类非常相似。还有一种不同的方法是向免疫供体或混合性严重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴细胞，通过抗原免疫使小鼠脾细胞融合骨髓瘤细胞 5。 转基因小鼠制备的人抗体，其功效优于其他技术生产的抗正
12、常人体蛋白单抗。小鼠识别抗原和动员抗原的抗体系统仍保持完整，容易把人体蛋白识别为异物。此外，由于抗体是体内产生的，经历了正常装配和成熟过程，从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。但转基因小鼠也存在一些缺陷，即转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列，导致不完整的人序列；而且，由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化的模式，所以这些单抗最终并不是全人源化的。需要进一步研究以改进此技术。3 总结限于嵌合抗体和改型抗体仍保留部分免疫原性，仍会导致部分反应，现在研究者已经渐渐开始转向更安全有效的全人抗体。最早制备全人抗体的方法是采用噬菌体表面呈现技术筛选获得的针对目标抗原的人抗体可变区基因，再
13、采用基因工程技术进行重组表达，但是这种全人抗体往往亲和力较低。现在，全人抗体几乎完全转向转基因小鼠产生。如果能更好地解决动物的传代问题，转基因动物生产人源化抗体的技术必将得到广泛的应用，极有可能代替动物细胞培养，成为大规模生产人源化抗体药物的常规技术。讨论和展望近年来，无论是学术界还是商业团体，都对治疗性抗体的研究表现出越来越大的兴趣。人源化抗体和全人源化抗体的出现，为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望。但人源化抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。由于影响抗体免疫原性的因素很多，如抗原呈递方式、次级信号系统及患者的个体差异等，而抗体人源化只能解决其中的部分
14、问题，其广泛应用还有待于对抗体效应机制及机体免疫系统调节机制进行更加细致深入的研究 9。在近年美国批准的新药中，已有多种人源化单抗进行了临床试验，其中数十种抗体相关新药得到了应用。目前，抗体人源化方法还在不断发展和完善，目标是提高抗体亲和力、降低抗体异原性，同时兼顾抗体的免疫学活化作用。另外，针对不同的异源抗体，选择合适的人源化途径来构建更适合于临床应用的人源化抗体，将为新药的开发和一些顽固疾病的治疗开辟新的路径。参考文献1 林芸,阎锡蕴.人源化抗体研究历程及发展趋势 . 生物工程学报,2004, 20(1): 1.2 胡春艳,刘全忠 . 单克隆抗体制备技术及应用的研究进展 J. 安徽预防医学
15、杂志,2008 年 3 月 20 日,第 14 卷第 3 期.3 吴永强. 人源化单克隆抗体研究进展 J. 微生物免疫学进展，1005-5673（2008）02-0073-05.4 史久华编译 . 全人单克隆抗体与人源化单克隆抗体. 国外医学 预防、诊断、治疗用生物制品分册,2002 年,第 25 卷,第 1 期.5 胡迪超,张爱华 ,杨晓明 .人鼠嵌合抗体的基因构建.中国生物制品学杂志,2009,9(22):933-937.6孙红,岳玉环 ,朱平.单克隆抗体人源化的进展及应用.中国生物制品学杂志,2008,1(21):70-73.7王秀红.基因工程抗体研究进展,生物技术通讯,2007,18(2):304-306.8侯佩强.噬菌体抗体库技术及应用研究进展.疾病控制杂志,2005,4(9):161-163.9 潘萌,等.单克隆抗体药物的研究进展J.中国生化药物杂志,2008,29(1):62- 64.10 康向东, 马艳春,张隆等.抗人甲状腺球蛋白人源化单克隆抗体的制备 J.检验医学,2009,24(2):97-100.
