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1、1AccQTag 法测定复方氨基酸注射液(18AA)中 17 种氨基酸的含量作者：陈宇堃,梁蔚阳, 薛巧如,王淼 【摘要 】 目的 建立测定复方氨基酸注射液(18AA) 中 17 种氨基酸含量的方法。方法 采用 AccQTag 法，以 6氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂，与复方氨基酸注射液(18AA) 中 17 种氨基酸柱前衍生，用 Waters 2695 HPLC 仪器，AccQTagTM 柱，以醋酸钠 (pH4.95)缓冲液为流动相 A，乙腈为流动相 B，水为流动相 C 进行梯度洗脱，检测波长为248 nm，柱温为 37 ，进样量为 5 L。结果 17 种氨基酸的线性回
2、归方程 r 值为 0.999 60.999 9(n=5)，平均回收率为93.3%104.4（RSD 值为 0.88%3.05，n6） 。结论 本法快速，简便，结果准确。 【关键词】 AccQTag 法；复方氨基酸注射液(18AA) ；6氨基喹啉N 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC） ；柱前衍生化法Abstract:Objective To analyze the contents of 17 amino acids in compound amino acid injection using AccQTag method. Methods The amino acids in the injec
3、tions were 2pretreated with 6aminoquinolylNhydroxysuccinimdyl separately and their derivatives were analyzed on Waters 2695 HPLC using AccQTag column. Gradient eluents consisted of sodium acetate solution (pH4.95), acetonitrile and water. The Detection wavelength was 248 nm and column temperature 37
4、 . Results The calibration curves for 17 amino acids had good linearity(r=0.99960.9999,n=5). The mean recoveries of 17 amino acids were 93.3%104.4% with RSD 0.88%3.05%(n=6). Conclusion The method is quick, simple for the content analysis of the amino acids in the injections.Key words:AccQTag method;
5、 compound amino acid injection; 6aminoquinolylNhydroxysuccinimdyl carbaminate(AQC);precolumn derivatization复方氨基酸注射液(18AA) 主要含 17 种氨基酸，包括门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、盐酸组氨酸、盐酸精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。复方氨基酸注射液用于治疗由于胃肠道疾病引起的消化和吸收障碍而造成的蛋白质缺乏症；因手术创伤、烧伤而需要增强蛋白质消耗者；因某些疾病而引起的3低蛋白血症；在手术前后营养不良时
6、，增加氨基酸的供应使体内达到正氮平衡，促进伤口愈合，体力恢复；消耗性疾病或癌症因化疗引起的食欲降低，需补充蛋白质摄入的患者1 。本文采用AccQTag 方法2，3测定该制剂的氨基酸含量，以 6氨基喹啉N 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂与各氨基酸柱前定量衍生后，再经 AccQTagTM 柱梯度洗脱。结果表明本方法具有专属性，且简便、快速、灵敏度高、重现性好。1 试剂与试药门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、盐酸组氨酸(HisHClH2O)、盐酸精氨酸(ArgHCl)、苏氨酸(Thr) 、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr) 、缬氨
7、酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、盐酸赖氨酸 (LysHCl)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu) 、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸 (Trp)对照品均为中国药品生物制品检定所提供（批号：624200104） ，质量分数均为 100.0。6 氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（简称 AQC） 、AQC 稀释液和硼酸盐缓冲液（pH8.8）均为 WATERS 公司提供。复方氨基酸注射液（18AA ） （规格：500 mL16.12 g;批号：0604281、0603285，广东利泰药业有限公司提供；批号：051101，广东庆发药业有限公司提供） ，乙腈（色谱纯） ，其他试剂均为分析纯。4仪器：Wate
8、rs EMPOWER 色谱工作站，Waters 2695，2487 检测器。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱 AccQTagTM 柱（3.9 mm150 mm，4 m） ；柱温：37 ；检测波长：248 nm；进样量： 5 L；流速：1.0 mL/min。 流动相 A：取乙酸钠（三水合乙酸钠） 19.04 g，加 1 000 mL 水溶解，用体积分数 50的磷酸溶液调至 pH5.2，加入EDTA 工作液（100 mg EDTA 加水至 100 mL）1.0 mL，加入2.37mL（1.72 g）三乙胺，用体积分数 50的磷酸溶液调至pH4.95，0.45 m 滤膜滤过并脱气 20 s，即可
9、；流动相 B：乙腈；流动相 C：超纯水；按表 1 进行梯度洗脱。表 1 梯度洗脱表(略）2.2 标准曲线的制备取 105 干燥 3 h 的 17 种氨基酸对照品，按照处方量分别精密称定，加 6 mol/L 盐酸溶液溶解，制成含总氨基酸浓度为 250 mol/L 的贮备液。精密量取对照品贮备液适量，用超纯水稀释成含5总氨基酸为 5 mol/L 的对照品溶液。精密量取对照品溶液 10 L，置 0.4 cm5 cm 的小管中，加硼酸盐缓冲液（pH8.8）70 L，混匀，加入衍生试剂 AQC 溶液（AQC 试剂 1 瓶加 AQC 稀释液 1 mL，置 55 烘箱中使溶解，即得。 ）20 L，混匀，置
10、55 烘箱中 10 min，即可。分别精密量取1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 L 注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积（A）对质量浓度（）进行线性回归计算，17 个氨基酸的回归方程及线性范围见表 2。表 2 回归方程及线性范围 (略）2.3 系统适应性试验在上述条件下，各氨基酸的理论板数为 15 738313 955，分离度为 1.412.4，见图 1、图 2。2.4 精密度试验取线性试验项下对照品溶液依法衍生后，连续进样 6 针，各氨基酸峰面积的 RSD 见表 3。表 3 精密度试验结果 (略）2.5 加样回收试验精密量取已知含量的样品（批号：0603285）适量，加入氨6基
11、酸对照品贮备液适量，稀释成浓度分别为 80、100 、120的溶液。按“2.2”项下试验的条件，精密量取 5.0 L 进样测定，各氨基酸的平均回收率与 RSD（n6 ）见表 4。表 4 加样回收试验结果(略）2.6 最低检测限试验精密量取对照品溶液适量，稀释成总氨基酸浓度为 0.01 mol/L 的溶液进样 5.0 L，记录色谱图，酪氨酸(Tyr)的峰高与基线比约为 31，检出限为 23.001 3 pg。2.7 稳定性试验取衍生后的样品，15 中放置 24 h，再次测定，所得结果与原测定结果一致。2.8 样品测定精密量取样品适量，稀释成含总氨基酸 5 mol/L 的溶液。按“2.2”项下试验
12、的条件，精密量取 5.0 L 进样测定，记录色谱图；另取“2.2”项下对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，样品测定结果见表 5。表 5 3 批样品测定结果(略）73 讨 论3.1 流动相 A 的 pH 值对结果影响较大，配制时要求 pH 值精确至小数点后第 2 位。3.2 如衍生试剂峰大于衍生空白样中 AMQ 峰的 80，可能是衍生时混合不均匀，衍生时应在样品涡旋状态下加入衍生试剂，以确保充分混合。3.3 如 Gly 峰与 HisHClH2O 峰的分离度不能达到要求，可能是初始梯度太陡，可减少 B 相梯度增量 1%2。3.4 如 HisHClH2O 峰与 NH3 峰的分离度不能达到要求
13、，可能是初始 B 相第一或第二梯度太平缓，可适当增加梯度增量1%2。3.5 如样品加入衍生试剂后呈黄色，则无法准确测定结果。可能是由于样品中盐的存在，导致样品未被正确缓冲，pH 值偏酸性，可以通过除盐或限制取样量的方法调整溶液的 pH 值。也可能是由于样品水解时 HCl 过量导致溶液偏酸性，应在衍生反应前除去HCl。83.6 因每台仪器与色谱柱的状态不一致，可根据具体情况对梯度进行 1%2的小增量变化，以达到最佳分离效果。3.7 本法简便快捷准确，精密度、重现性好，专属性强，可对样品含量进行有效的控制。【参考文献】1朱风春，翁玉文，赵玉杰.复方氨基酸注射液临床的合理利用J.哈尔滨医药，1996，16（4）：39-402陈华.AccqTag 法测定田参氨基酸胶囊中氨基酸的含量J. 广东药学院学报，1998，14（2）：119-120.3梁蔚阳. AccqTag 法测定复方精氨酸胶囊中精氨酸的含量J.中国药品标准，2003，229（4）：37-38.
