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1、172 例喉癌患者耐药基因与临床预后关系的初步探讨作者：张青俊 张凡 徐国刚 尚小领 张九龄 【摘要 】 目的:探讨喉癌患者中耐药基因 P 糖蛋白（Pgp ） ，谷胱苷肽转移酶(GST)，DNA 拓扑异构酶 （Topo ） ，胸苷酸合成酶（TS）表达的临床意义。方法：用免疫组化方法检测 72 例喉癌组织中的 Pgp、GST、Topo和 TS，分析其与临床病理资料及预后的相关性。结果：72 例喉癌患者中， Pgp 阳性 66 例、GST阳性 50 例、Topo阳性 28 例、TS 阳性 12 例。Pgp 的表达与病理分型、临床分期、淋巴转移及局部复发均相关，GST、Topo的表达与淋巴结转移相关
2、，TS 的表达与各项指标均无明显相关性。患者的病理分级、临床分期、术后是否复发及 GST 的表达均与术后生存时间明显相关。结论：喉癌患者 Pgp、Topo、GST、TS的联合检测十分必要，病理分级、临床分期、术后复发及 GST 可以作为判断喉癌患者预后的指标。 【关键词】 喉癌；多药耐药；免疫组化；预后【ABSTRACT】 Objective：To study the relationship between the expression of pglycoprotein(pgp),glutathionestranferase(GST),topoisomerase （Topo） and the
3、midylate synthase（TS）and the clinical pathological characteristics of the patients with 2laryngeal squamous cell carcinoma.Methods:The expressions of pgp、GST、Topo、TS proteins were detected by immunohistochemistry method in 72 patiens with laryngeal squamous cell carcinoma who were followed up more t
4、han five years.Results:The expression of pgp was associated with histological grading、UICC staging、lymph node metastasis and recurrence; The expression of GSTand Topowas associated with lymph node metastasis; survival rate was correlated with histological grading、UICC staging、recurrence and GST.Conc
5、lusion: Histological grading、UICC staging、recurrence and the expression of GSTcan be redarded as progonosis facters in laryngeal carcinoma.【KEY WORDS】 Laryngeal carcinoma；Drug resistance; Immunohistochemistry ;Prognosis喉癌是耳鼻咽喉头颈外科三大恶性肿瘤之一，发病率较高，一直以来喉癌的治疗模式以手术治疗为主，辅以术前术后放疗。中晚期喉癌患者手术治疗后，尤其全喉切除加颈部淋巴结清扫
6、，生活质量明显下降，而化疗+(-) 放疗可使患者保留患病喉组织，提高生活质量。在治疗的实际应用中，由于多药耐药的出现，致使化疗的效果3并不尽人意。为探讨喉癌中耐药基因蛋白的表达与肿瘤的临床病理特征预后之间关系，我们选取 72 例喉癌患者用免疫组化方法进行研究。1 资料与方法11 一般资料选取 1996120001 月河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科诊治的喉癌病人 72 例，每例均有完整的临床及病理资料、手术记录及 5 年以上的随访资料，所有病人术前均未行放射或化学治疗。其中男 67 例，女 5 例；年龄 3280 岁，平均年龄 5693 岁；根据 1997 年 UICC 分期标准，期
7、17 例， 期 7 例，期 26 例，期 22 例；72 例中有淋巴结转移的 29 例，无转移的 43 例；病理类型及分级：高分化鳞癌 28 例，中分化鳞癌 41 例，低分化鳞癌 3例；手术方式：其中行喉裂开术 9 例，喉垂直部分切除术 8 例，喉声门上水平部分切除术 16 例，喉 3/4 切除术 3 例，喉近全切除术6 例，全喉切除术 29 例；经过 5 年的随访观察，23 例死亡，5 年生存率 6805%。12 试剂和方法4所有标本经 10%甲醛固定，石蜡包埋，制成 4m 的连续切片,TS、Pgp、GST 和 Topo一抗试剂盒均购自北京中山试剂公司。免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水
8、,3双氧水灭活内源性过氧化酶,PBS 缓冲液振洗（采用专业微波炉进行抗原微波热修复） ，正常山羊血清封闭，一抗冰箱过夜，二抗、三抗各 1h，DAB 显色1015min，复染核脱水透明，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照,用已知阳性的结肠癌或肝癌组织作阳性对照。结果判断标准：光学显微镜下以细胞膜、浆、核中存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性,其中 Pgp 阳性颗粒分布于胞浆和/或胞膜,GST 阳性颗粒分布于胞浆和/或胞核,Topo阳性颗粒分布于胞核，TS 阳性颗粒分布于胞浆。根据染色的细胞数量及染色强度分为阴性(-):无阳性细胞染色;弱阳性 (+):阳性细胞 1%25%;中度阳性
9、(+): 阳性细胞 26%50%; 强阳性(+):阳性细胞 50%。13 统计学处理应用 SPSS100 统计软件进行处理，采用秩和检验分析其相关性。2 试验结果572 例喉癌患者病例中， Pgp 阳性 66 例、 GST 阳性 50 例、Topo阳性 28 例和 TS 阳性 12 例。Pgp、GST 在无淋巴结转移患者中的阳性率明显低于有淋巴结转移者，Topo在无淋巴结转移患者中的阳性率明显高于有淋巴结转移者（见表 1） 。Pgp、和 GST 阳性表达的患者其程度有较大差别，其与临床病理特征及 5 年生存率的关系（见表 2） ，显示临床分期越晚则 GST的表达强度越高；而 Pgp 阳性表达强
10、度与各个相关指标均相关，即表达愈强则病理分型越差、临床分期越晚、淋巴转移越多、复发率越高、5 年生存率越低。临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系（见表3） ，分析显示患者的病理分级、临床分期、术后是否复发及 GST的表达均与术后生存时间明显相关。即病理类型临床分期较重、出现局部复发和 GST 的表达水平越高，患者的生存时间越短，5 年生存率越低。表 1 TS、Pgp、GST 和 Topo阳性表达与临床资料的关系表 3 临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系3 讨论早期喉癌很少发生远处转移，所以喉癌的治疗一直以来以手术和6放疗为主，预后较好。各家报道稍有区别，季文越1等
11、报告 1115例喉癌患者的 5 年生存率， 期为 94%， 期为 89%，期为82%，期为 66%。喉全切除术 565 例，5 年生存率 68%，喉部分切除术 550 例，5 年生存率 85%。术后生存率与临床分型分期、淋巴是否转移及手术方式有关。我们所选的 72 例患者中、期24 例，5 年生存率 875%；、期 48 例，5 年生存率 583%。全喉切除 29 例，喉部分切除 43 例，5 年生存率分别是 517%和 790%。统计分析喉癌患者的术后生存与其病例分级临床分期及术后是否复发有关，与国内外相关报道一致，而该组患者总体 5 年生存率 685%，较其它报道低可能与其临床分型以声门上
12、型为主，分期、期较多及手术方式选择有关。肿瘤的多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞对多种结构功能不同/ 杀伤机理迥异的化疗药物同时产生交叉耐药现象。其机制主要有以下几个方面：一是肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1 ）及其表达产物P 糖蛋白（Pgp）介导的多药耐药现象，成为典型多药耐药；二是由拓扑异构酶介导的，称为非典型多药耐药；三是谷胱甘肽 s 转移酶的表达；四是胸苷酸合成酶的表达。Pgp 是 MDR1 细胞膜上一种分子量为 16864u 的膜糖蛋白,该蛋白跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能,发挥将细胞内药物主动转运至细胞外的作用,使细胞内药物蓄积减低药量减少，从而使细胞对7该药产生耐药，同时对不同的
13、亲脂类药物产生交叉耐药。已有研究表明，MDR1 在宫颈癌、肾细胞癌、肝癌中通常高水平表达；蔡晓岚等2应用逆转录多聚酶链式反应技术，检测了 35 例喉癌患者MRPmRNA 的表达，结果显示阳性率 457%，其阳性表达强度在晚期肿瘤中明显增高，且与肿瘤颈淋巴结转移明显相关。我们的实验结果显示：喉癌患者 Pgp 阳性率 916%，其表达阳性率与患者是否发生淋巴结转移呈相关性，有淋巴结转移阳性率明显高于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异。Pgp 阳性表达与术后生存时间之间无明显相关性，不能作为判断喉癌预后的指标。其阳性表达强度在病理分级、临床分期、淋巴结转移与否、肿瘤是否复发及 5 年生存与否之间均
14、有显著性差异。即病理分级越差、临床分期越晚、有淋巴结转移、5 年内复发及转移、生存不足 5 年者表达程度越高。GST 是一种多功能药物代谢酶,不仅可催化亲电物质与谷胱甘肽结合, 而且本身可以与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性,促进其代谢, 从而降低抗癌药物的细胞毒作用而产生耐药。GST 主要分布于消化道、泌尿道、呼吸道上皮，其表达与结肠癌临床分期呈正相关。GST 阳性则对顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁、阿霉素等药物疗效不佳。Arai 等3报道 GST 阳性表达对顺铂加足叶乙甙的化疗方案敏感,可作为化疗疗效的预测因素之一。Deffie 等4认为 GST含量增加是阿霉素耐药因素之一。我们的试验显示：
15、GST 阳性率694%，其表达强度与喉癌的淋巴结转移及 5 年生存率呈相关性，8有淋巴结转移阳性率明显高于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异，生存时间大于 5 年者阳性率明显小于生存时间不足 5 年者。GST 表达阳性率与术后生存时间相关，生存时间越短则阳性率越高，因此认为 GST 可以作为临床预后的指标。GST 阳性表达程度与临床分期及 5 年生存率相关，表达越强则临床分期越晚，5 年生存率越小。Topo是一种能催化 DNA 双链拓扑异构体相互变换的基本核酶5，在哺乳类动物体内，它有两种同工酶 Topo 和 Topo ，它们是不同基因的产物。其中，Topo 是许多 Topo 抑制剂如胺吖啶
16、、蒽环类、鬼臼毒素及依托泊甙等的重要靶点，故细胞内Topo 水平直接影响 Topo 抑制剂的抗肿瘤作用， Topo表达水平越高则对抗癌药物敏感性越高，而 Topo 数量减少或活性下降则导致 Topo 抑制剂细胞毒作用降低，从而引起多药耐药现象。我们的实验结果显示 Topo阳性率为 416%，其表达阳性率与患者是否发生淋巴结转移呈相关性，有淋巴结转移阳性率明显低于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异。而与其他临床病理指标无相关性，与术后 5 年生存率及生存时间亦无相关，不能作为喉癌预后的指标。TS 是胸甘酸合成的限速酶6，可使 dUMP 甲基化形成dTMP,dTMP 为 DNA 合成基本原料 dTTP 的前体，其在 DNA 合成9与修复中起重要作用。因此，TS 成为肿瘤化疗中重要的靶向酶。多数研究
