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1、1骨髓间充质干细胞在造血重建中的作用作者：范东艳 郭丽 孟繁凯 陈强 凌翎 王欣 范洪学【摘要 】 目的 探讨骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC ）在造血损伤修复中的作用。方法 将同系小鼠股骨、骨壳、注入骨髓条的塑料管及经 20 Gy 射线照射的股骨分别植入同一小鼠腹部皮下，观察 1、2 、3、4 w各移植物造血重建情况。观察髓腔内微循环结构与机能、组织学、分化不同阶段的造血细胞数目与机能等变化，以及骨皮质体外间充质干细胞(MSC)培养与扩增规律。结果 乏造血干细胞(HSC)的骨皮质异位移植完全可以造血重建，在移植后 4 w，移
2、植物已形成完整的封闭的具有正常造血组织的股骨，其重建的程序、速度与具有大量 HSC 的完整股骨移植的重建基本一致。而经射线破坏和注入塑料管内的骨髓条完全失去造血重建功能。结论 骨皮质可能是骨髓MSC 的源泉，BMMSC 是造血重建的不可缺少的因素。 【关键词】 间充质干细胞；造血重建；移植【Abstract】 Objective To discuss the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) on the hematopoiesisrecovering. Methods The femoral bone with 2bon
3、e marrow, plastic tube with bone marrow plugs and the femoral bone irradiated by 20 Gy irradiation obtained from the syngeneic mice were ectopically transplanted into abdominal subcutaneous of the same mouse, and the hematopoieticreconstruction of all the graft were observed on 1, 2, 3, 4 week (w) a
4、fter transplantation. The observation indexes included microcirculation structure and function, histology, the varieties of hematopoietic cells number and function and so on in different differentiated stage and the culture and expansion regulation of MSC derived from femoral bone without marrow. Re
5、sults The femoral bone without hemopoietic stem cell (HSC) could be hematopoieticreconstruction completely after ectopic transplantation. The graft formed complete and close femoral bone with normal hematopoietic tissue after 4 weeks of transplantation and the procedure and speed of reconstruction s
6、eemed to coincide with the abundant HSC femoral bone. The plastic tube with bone marrow plugs and the irradiated femoral bone lost hematopoieticreconstruction function completely. Conclusions The femoral bone shaft without bone marrow may be the resource of MSC and BMMSC is necessary factor 3in hema
7、topoieticreconstruction.【Key words】 Mesenchymal stem cells; Hematopoieticreconstruction; Transplantation应用骨髓细胞移植（bone marrow transplant，BMT ）治疗白血病、极重度急性放射病等危难性疾病实际上是造血重建过程，也是移植的供体干细胞在受体内归巢、增殖、分化重建造血结构，以取代完全损伤或破坏的受体造血组织，并建立免疫嵌体，即新生的免疫活性细胞对受、供体双重组织的主要组织相容抗原（MHC）均具有免疫耐受性，而对第三者组织完全排斥。在造血重建过程中造血干细胞（hemat
8、opoietic stem cell,HSC）是关键因素，必须保证供、受体组织的 MHC 一致（配型完全相合） 、足够的干细胞数量以及恰当的移植时间等才能使移植成功。但作为维系造血细胞更新系统，尤其是 HSC 长期处于生理状态的调控机构，即造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)其主导成分间充质干细胞(mesenchymal stem cellsm，MSC) 的作用，即在造血重建过程中，间充质干细胞是否仍然是调控造血细胞增殖与分化的中心，可否认为完整的 HIM 是保证 BMT 成功的先决条件等尚不清楚。为此，本文观察了完整股骨、骨皮
9、质、注入塑料管内的骨髓条及遭受 20 Gy 体外照射的股骨等异位移植后造血重建的动态变化。41 材料与方法1.1 动物 雌性 B6 小鼠，46 月龄，体重（182）g。供体小鼠 12 只，受体小鼠 12 只，购于吉林大学医学部实验动物中心。1.2 方法1.2.1 实验步骤 将小鼠脱臼处死，取出股骨、剪去两侧骨骺端，用培养液冲出骨髓条后再将骨壳冲洗三次，保留骨髓条的股骨和注入塑料管内的骨髓条以及体外经 20 Gy 照射的股骨等四种处置的股骨，分别异位移植在同系、同一只小鼠腹部皮下，观察移植后1、2 、3 、 4 w 移植物造血重建情况。1.2.2 造血组织微循环结构与机能观察及分化不同阶段的造血
10、实质细胞机能与数量观察 造血组织微循环结构与机能观察采用墨汁注射透明标本制作法。多能造血干细胞机能与数量观察采用脾结节法（CFUs ） ，粒系祖细胞机能与数量观察采用体外琼脂培养法(GMCFU)，有核细胞计数采用计数法。均采用文献1方法。1.2.3 BMMSc 体外培养、扩增观察 将骨皮质碎片与骨髓5细胞分别植入培养瓶内进行培养（37、100%湿度、5%CO2） ，培养体系 PRMI1640 培养液，20%胎牛血清，每周换液一次。观察细胞生长速度、状态，并进行形态学检查。2 结果2.1 移植物腔内微循环的重建 骨皮质移植后 1 w，皮质内血管明显扩张、充血，墨汁充盈良好。在两端部见血管随腔长入
11、并渐见到造血组织特有的静脉窦结构，其余部位多为血液或无色透明区；第 2 周移植骨壳两端已见明显充盈墨汁的静脉管网，但为数不多，分布比较局限；第 3 周移植骨两端静脉窦网向中心扩展，大约可占骨腔的一半。移植后第 4 周一半移植骨壳内静脉管结构基本完成重建，中央静脉、集合静脉窦及静脉窦网均清晰可见，位置排列与正常结构基本一致；另一半移植骨壳内也可见大量静脉窦网，但仍见有部分地方还有一般微血管结构，重建尚不明显。而股骨移植物移植后 1 w 见血窦破坏，墨汁充盈不佳和外溢，呈一片破坏景象。移植后 2 w 骨髓腔内墨汁不充盈，但可见两端有血管长入并形成少许静脉窦结构，移植后 3 w 及 4 w 与骨壳移
12、植的血管重建程度基本一致，而注入骨髓条的塑料管内和经 20 Gy 照射的股骨髓腔内则见不到血管长入现象，也见不到静脉窦结构。2.2 移植物腔内造血组织的重建 移植后 1 w 的骨皮质腔内为血液充满，在其两端已有基质细胞生长，胞体大，形态多样，核6圆及椭圆型、深染。皮质内细胞肿胀，基质疏松，可见细胞向腔内游离现象。皮质内福克曼氏管与哈佛氏管血管扩张，细胞增生。2 w 的移植物腔内血液基本被吸收，骨壳腔内几乎全部为新生小梁所占据，小梁间隙充满新生的扩张的静脉窦网。在两端腔内已见有造血灶出现，主要分布在充血的静脉窦周围，周围的小梁结构减少，移植后 3 w 移植物两端已被骨质封闭，在含有大量新生小梁的
13、骨髓腔内可见多数造血灶，由两端向中心部漫延。第 4 周移植的骨皮质已成长为完整的长管状骨、髓腔内充满了各类分化不同的造血细胞。血管完整但轻度扩张，骨小梁数目减少。也见有移植物一端为完整造血结构而另一端为脂肪细胞或长入的纤维组织所占据。异位移植的股骨移植后 1 w 髓腔内出现明显充血、出血、细胞碎片随处可见，移植后 2 w 骨髓内可见坏死、清除，基质细胞增生、血窦新生及造血细胞再生四个阶段。这四种变化以中间向两端移行，中心坏死区可见大量细胞碎片、出血，在坏死区两端见出血被吸收，散布少许基质细胞并有新生血管出现，此区两端为基质细胞增生、血窦生成区，可见大量活跃基质细胞，胞体大，呈圆形、三角形和多角
14、形，嗜酸性，核大呈圆形或椭圆形，核分裂象较多。血管丰富充血，最外侧两端即为造血细胞增生区，基本在两端见大量骨小梁，周围见扩张静脉管和少许新生造血灶（图 1） 。随着植入时间延长，坏死细胞逐渐被清除，基质细胞增殖，随着血窦增加，造血灶也增多。在移植后第 3 周已见不到坏死现象，基质细胞增生活跃，血窦布满移植物腔内，造血灶增多。到第 4 周基本同骨皮质移植的造血重建程7度一致（图 2） 。经 20 Gy 照射股骨移植后 1 w 可见坏死、清除等变化，以后随坏死区扩大，纤维组织长入，逐渐被机化，未见新生造血组织。而注入骨髓组织的塑料管内未见造血组织，仅见长入的微血管和浸润的粒细胞和巨噬细胞。图 1
15、造血重建初期的形态变化(200) （略）图 2 造血重建的组织学观察(200) （略）2.3 移植物造血细胞变化 移植后 30 d 造血细胞不论是CFUs、GMCFU 还是有核细胞计数，完整股骨、骨壳均有明显的恢复，而注入塑料管内的骨髓条和体外经 20 Gy 照射的股骨未见造血增生现象（表 1） 。骨髓移植物在受体内不同阶段的造血细胞在一定时间内增殖速率不同，但总体可以看出，随植入时间的延长细胞数目增多（表 2） 。表 1 移植后 30 d 造血细胞恢复情况（略）表 2 移植不同时间各类造血细胞变化（略）2.4 骨皮质及 BMc 源 MSc 的异同 将同一只 B6 小鼠去BMc 的骨皮质碎片与
16、 BMc 分别进行 MSC 体外培养发现，培养初8期（1 w）BMc 源的 MSC 细胞增生速度快，传代容易，细胞状态好，但易老化。传代 4 w 后，细胞开始老化，增殖速率减慢，而骨碎片培养，虽然开始增殖不明显，但 1 w 后表现出明显增殖活力，而且超过 6 w 保持旺盛的增殖。但两者富集的 MSc 系细胞的性质尚未作详细观察。3 讨论研究表明，造血微环境是造血细胞，尤其是 HSC 长期处于生理状态的主要调控因素，而造血基质干细胞（即造血间充质干细胞）是 HIM 的的主导成分，在维持体外扩增造血细胞的移植活性中，基质细胞具有非常重要的作用2 。近来证实， MSC 除具有“无限”增殖和多向分化双重机能干细胞所特有的性质外，还具有明显的可塑性，即它不仅向所属的组织器官内的基质细胞系细胞分化，还可在特定条件下跨越胚层向其它组织细胞转化，如内胚层的肝细胞、外胚层得神经细胞等，以促进或取代机体受损组织的恢复或再生35 。本研究表明，将去骨髓细胞的骨皮质异位
