藻类标本的采集和处理方法

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1、附录：藻类标本的采集和处理方法 藻类标本的采集 淡水 藻类种类繁多，各种藻类对环境条件的要求、也各不相同。有的是浮游种类，有的是底栖附着种类，生态条件各有其特点。想要采集某一种较好又较纯的理想的标本，就必须了解各种藻类的生态特点。有的藻类季节性很强 ,如金藻、硅藻等常在较低温的季节出现，又如蓝藻门的许多种类则常在温度较高的季节出现。眼虫藻、衣藻、卡德藻等常在有机物较多，静止的水体中大量出现。接合藻目的许多种类常在酸性，缺钙的水体中大量出现，如酸性红壤土地带的积水、沼泽以及水库下游积水处常可找到接合藻类。毛枝藻等附着性藻类常可在水中石块或其他附着物上采到。底栖硅藻 或具胶质柄的种类常在沉水植物或

2、其他丝状藻类上附着。欲得较纯的某些浮游藻类标本，可在形成水华的水体中采集得到。如眼虫藻常形成油膜状水华，而衣藻、隐藻、沟环藻等则形成绿色、黄绿色、墨绿色云彩状水华。浮游蓝藻类浮在水面时也常可采到较纯的优势种。此外还可利用藻类的趋光性，将采得的标本初步分离提纯，如衣藻等有鞭毛能运动且具趋光性，可与共他不运动的藻体分开。又如采得的颤藻常附有较多的泥砂，利用顫藻趋光能动，将它置于培养皿中，加入适量清水，放于柔光的北面窗口， 2 3 日后，无数顫藻散贴于培养皿的四周，此时用小镊子挑取，可得 较纯而无泥砂的顫藻。欲得纯粹的某些浮游藻类，可在采集得到的标本中分离培养。欲得较多、较好，种类较纯的好标本，需经

3、常在不同季节、不同的水域环境中，多加采集积累。 采集方法，浮游藻类通常可用浮游生物网 *，在水中作字形拖曳取得。也可采取一定的水量（通常 1 升）加固定剂，用浓缩沉淀法取得。底栖藻类，较大型的丝状或团块状标本，可以在采集现场从水中石块上或其他附着物上刮取。另一些小型的常附着在水草或枯枝烂叶水中其他物体上，采集时可连同其附着物一起带回实险室处理。 *浮游生物网系用筛绢缝制而成，筛绢 按其 孔目大小，有很多规 格， 采集 浮 游 藻 类用孔径最少的 x 26 号 筛绢 较好。 标本的固定 固定藻类标本最常用的固定剂是甲醛液（福尔马林 Formalin）或鲁哥氏碘液（ Lugols solution

4、）。 如果标本只作一般的形态分类观察用，在用浮游生物网所采得的标本中，加入福尔马林，使其含有 4%浓度即可，同时可作长期保存，若是直接取水样沉淀浓缩，则用鲁哥氏碘液加福尔马林最为适宜。 1 升水样中加鲁哥氏碘液 15 毫升左右，沉淀浓缩后再加福尔马林使其含有 3%浓度即可。此外 FAA（甲醛液、醋酸、酒精）或称标准固定剂。铬醋酸固定液等也是常用的藻类固定剂，它对进一步进行藻体结构的观察有良好效果。若要进一步观察细微构造，每种藻类则有自己的固定液，这例子不胜枚举，如眼虫藻属较好的杀死固定剂是萧丁氏液。鼓藻杀死固定剂为 23%甲醛固定后再加几滴醋酸。无隔藻可用甲醛 10 毫升醋酸 5 毫升 50%

5、酒精 100 毫升固定。团藻最好的杀死固定剂为碘化钾 2 克，碘 1 克，甲醛 24毫升，冰醋酸 4 毫升，蒸馏水 400 毫升。鞘藻、刚毛藻可用铬醋酸固定。易于破碎的标本可用 FAA 固定。 几种常用的固定液配方： 鲁哥氏碘液 Lugols solution 碘 4 克 碘化钾 6 克 蒸馏水 100毫升 (注：通常使用时常感太浓，可用蒸馏水稀释后使用） FAA(Forrmalin-aceto-aicohol) 标准固定剂 (甲醛液、醋酸、酒精混合剂） 甲醛液 5 毫升 醋酸 5 毫升 50%或 70%酒精 90毫升 铬酸 醋酸固定液 这种固定剂配方很多，在植物固定上用途 也广。通常在实验室

6、中常预先配制贮藏备用，其基液为 1 克铬酸， 1 毫升冰醋酸， 100 毫升蒸馏水。这种基液为 1%铬一醋酸液。基液一般不直接拿来作固定用，常稀释后使用。 在藻类上使用的为弱铬 醋酸液（ Weak Chromosome-acetic） 10%铬酸水溶液 2.5 毫升 10%冰醋酸水溶液 5.0 毫升 蒸馏水 92.5 毫升 标本的保 存与整 体封藏制片法 淡水藻类用 4%甲醛液或 FAA 固定后，即可长期保 存。鲁哥氏碘液固定的标本，由于碘易于挥发，长期保存尚需加些甲醛液。 若将标本制成封藏标本片，其方法很多，可参阅植物制片技术一书，基本步骤，一是杀生、固定。二是冲洗及脱水。三是染色。四是透明

7、及封藏。以下介绍几种方法，供制作时参考。 一、甘油封藏片制作法，可分不染色与染色两种。 (一）不染色方法， 1.标本用 4%甲醛液杀生固定。时间约 12 24 小时。 2.载玻片上，滴一小滴 10%的甘油液，吸取沉淀于甲醛液中的标本，滴在甘油液中，用针轻轻搅动，使标本均匀散布。 3. 将载波片放在干燥器或大形容器中，注意防尘，使甘 油中水分逐渐蒸发，时间随干燥情况而定。待甘油浓缩至原来一半时，即可加一滴 20%甘油，再静置使水蒸发，然后再加 40%甘油。待甘油浓缩至原来容量一半时，即可加盖玻片，仍使继续蒸发。 4.2 3 天后，甘油已达到近于无水状态，此时即可进行密封。 5.密封：甘油制片法，

8、密封剂需采用洪氏两液。洪氏两液配法，阿拉伯树胶 20克，蒸馏水 20毫升，水化氯醛 17 克，甘油 3 毫升，冰醋酸 2 毫升。 用毛笔蘸上述洪氏两液涂在盖玻片四周及片面的边缘部 (约 0.5 1.0 毫米）。过 1 2 天，此时涂片已干，用刀轻轻刮去盖玻片四周不平整的洪氏两液 ，并可再用瓷漆在四周进行加固密封。 (二）染色方法：（材料以丝状绿藻为例） 1.标本用弱铬 醋酸液固定 24 28小时。 2.将材料倾入广口瓶中，瓶口用纱布包扎，然后在自来水龙头下冲洗，以除去标本中固定液，时间至少 24 小时。 3.移入 2%铁矾液中， 2 小时。 4.再用自来水冲洗 30 60分钟。方法同第二步，冲

9、洗水不可太急。 5.用 0.5%海氏苏木色素染色 3 24小时后，用水冲洗 30分钟。 (苏木色素，溶于蒸馏水中，需 10天之后，在这段时间中，须经常摇晃玻瓶，以加速溶解，此液配好后需等两个月时间，才可使用 *） *等两个月时间是为了使苏木色素完全成熟，即让其自然氧化成氧化苏木色素后才能使用。 用 2%铁矾溶液分色，直到满意为止（如染色较弱， 4 5 分钟已足够）。再在水中冲洗约30 60分钟（冲洗必须彻底，否则封藏后仍继续分色，最后完全失去颜色而失败 )。 7.将标本放于2%甘油中，以后根据不染色法中使甘油水分蒸发，逐级加浓，加盖玻片，以洪氏两液密封和瓷漆加固。二、甘油胶封片法，这种方法用于

10、藻类整体封藏极为良好，即使不经密封的片子，也可以保存一、二十年。 甘油胶的配方： 白明胶 1 份 纯甘 油 7 份 蒸馏水 6 份 麝香草酚 (或酚） 少量 配制时先把明胶放于盛有蒸馏水的烧杯中，加热 35使其溶化，然后等明胶化成稠胶，再加人甘油继续加热 15 分钟，并用玻棒搅拌，再在每 100克上述混合液中加入麝香草酚或 1 克作防腐用。以后再加热，继续搅拌，直至麝香草酚消失为止。这时可把甘油胶用细纱布过滤后，放入瓶中备用。甘油胶可保存相当久的时间，用时只需用刀刮取少量胶 (其大小如绿豆一粒 )，加于载玻片的标本上 ，略加微温，使它溶化即可，然后覆以盖玻片即成。如能在盖玻片周围用漆密封，则更

11、可永久保存。 三、合成胶水封藏法：为了简化制片手续，最简易的方法可用文具商店出售的合成胶水封片，为了防腐可在胶水中加入少量防腐剂（如加 4%甲醛液也可以。制片时吸取用 4%甲醛液固定的标本一小滴于载玻片上，待标本水分蒸发近乎干燥时，滴上一小滴合成胶水，加上盖玻片即成。 四、叔丁醇树胶封片法，在整体封藏法中，一般认为此法很合乎理想，片子质量很好。唯手续较繁，步骤如有颠倒，常会失败。 1.固定液的选择，应根据标本而定，通常用弱铬酸醋酸液。 2.杀死固定后，用水彻底冲洗。 3.若染色，可用水溶性染剂染色，其中以各种苏木色素或洋红混合剂中的梅氏铁矾洋红较为适用。 4.染色后可进行分色，分色须明显，但不

12、能褪色过甚。分色后，须用水彻底洗去分色剂。 5.脱水，经 15%、 30%、 50%及 70%各度酒精，每级至少须 20分钟。 6.移入 85%酒精中 18 24小时。 7.可用各种细胞质染剂作二重染色，如用苯胺蓝或快绿。一般约 15 分钟。 8.倾去二重染色液，立即用 95%酒精洗去标本中多余的染剂，并换一次 95%酒精，然后立即进行叔丁醇的逐级代替法。把叔丁醇每隔半 分钟加入一些，不可太快，以免叔丁醇在酒精中高度扩散作用，在每加入 3 4 次后，应倾去 些混合液，然后再逐渐加入叔丁醇，直到容器中叔丁醇与 95%酒精成 9:1 为止。 9.将容器中 9:1 的混合液倾去大半，立即加入用 10

13、 倍叔丁醇稀释的加拿大树胶。树胶用量至少要 5 8 倍于标本，然后置于无尘的地方，使叔丁醇慢慢蒸发，直至树胶稠密至可以封藏为止。 10.等叔丁醇蒸发将要完时，用小镊子轻轻取出标本，放在清洁的载玻片中央，取盖玻片用加拿大树胶封藏。 五、浮游类涂抹制片法， 1.标本用弱铬酸醋酸液 (或 4%甲醛液、或鲁哥氏液均可 )固定。固定时间一般需 24 小时。 2.取清洁载玻片，上面涂一薄层梅蔼氏粘附剂（梅蔼氏粘附剂配法，取新鲜鸡蛋一只，只取蛋白，再加入等量的甘油和 1 克水杨酸钠充分混合即成。此粘附剂以新配合的效果好，放置过久粘力减低，通常可保存 2 6 月）。然后用吸管吸取标本，滴在涂有粘附剂的载玻片上

14、。 3.用盖玻片盖一下，使标本自然散开，然后拿掉盖玻片，将做好的涂片，放置无尘处，等其水分逐渐蒸发到接近干燥为止。 4.将涂片浸于盛有清水的培养皿中 (涂抹的一面向上 )，以除去本中的固定剂，须换水三，四次，每次 30分钟。再将涂片移入蒸馏水中 30 分钟。 5，移入 3 4%铁矾水溶液中约 12小时。 6.用流水缓慢冲洗，必须彻底，约 3 6 小时。静水换水也可以，但必须彻底洗净。 7.用 1%海氏苏木色素染色 24 48小时。染色时间视着色而定。 8.移入清水冲洗，以除去多余染剂，应换水数次，直至水不变蓝色为止。 9.移入 2%铁矾水溶液中（或苦味酸饱和液中）分色，约 10 分钟左右，如用

15、苦味酸则需 4 6小时。这一步时间多少，须经常在显微镜下检查，以求得适宜的分色。 10.等分色清晰后，移入水中冲洗，换水 4 5 次，以求彻底除去铁矾液或苦味酸液。 11.用蒸馏水冲洗 5 分钟（如拟用水溶性染剂如番红等作二重染色，则可在此步骤后，移入番红染剂中染色，染后再依一般规则进行冲洗）。 12.用各度酒精脱水，进度为 10%、 25%、 35%、 50%、 70%、 85%、 95%每级时间 5 分钟。 13.用纯酒精脱水 5 分钟（如欲用快绿、酸性品红、真曙红等作二重染色，即可在此步骤后，用这些染剂的纯酒精或丁香油溶液染色。染后，用丁香油透明及脱色。逐步由纯酒精丁香油移入丁香油二甲苯，以至纯二甲苯后，用加拿大树胶封片 )。 14.由纯酒精过渡到纯二甲苯。由纯酒精与二甲苯的比例 3:1 移入到 1:1，再到 1:3，再到纯二甲苯中，每级 5 分钟。 15.加盖玻片用加拿大树胶封藏。 六、硅藻