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1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸, 变性温度与时间,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变
2、性，就会导致PCR失败, 退火(复性)温度与时间,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想, 退火(复性)温度与时间,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时
3、间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度,Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合, 延伸温度与时间,Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行, 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,
