《WB实验步骤详细总结》由会员分享，可在线阅读，更多相关《WB实验步骤详细总结（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白提取（所有操作在冰上进行）1. 裂解1) 配裂解液：PMSF=100： 1，（裂解液和 PMSF 在-20保存，提前一天 4解冻）取 2ml 裂解液，加 20l PMSF 混匀2) 称取 30mg 组织，切碎放入标记好的 AP 管中，加入 600l 上述 1 中液体（加入液体与组织比例为 20：1），冰上静置 10min2. 匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆 10s，两次（间隔 5s），冰上静置 30min3. 离心（在基础 4 楼 416 室）1) 自带 1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个 1.5 的离心管（ ，两
2、个标记，加少量超纯水，号是为了离心平衡，对称放置）2) 将离心机预冷至 4为止，以 120010r/min 离心 15min3) 用移液枪将上层清液取出放入号管中4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至 23 个 0.5mlAP 管中加上样缓冲液，100变性 10min仪器屏幕：5. 保存变性结束后，打开 AP 管盖放一下气，然后 4保存，点样是取出即可用S5 00：10S5 1000 00：10温度（） 时间（时：分钟）WB实验步骤1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。2. 配制分离胶1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），20
3、0l 枪（黄色枪头）10 l（白色枪头）2) 10%分离胶的配置：（用 50ml 烧杯。1.0mm 板配 1.5 块胶，1.5mm 板配 2 块板）5.91ml 超纯水4.95ml 丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效3.75ml Ph8.8TrisHCL150l 10%SDS150l AP（催化剂促凝作用）9l TEMED混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）3. 灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用 1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4. 水封立即用 1ml 超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出
4、防止影响电泳效果，等待 20-30min5. 浓缩胶的配制（5%）4.13ml 超纯水1ml 丙烯酰胺（30% ）避光保存极易失效750l Ph6.8 TrisHCL60l 10%SDS60l AP（催化剂促凝作用）6l TEMED搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10 孔或 15 孔）凝胶 30min 或 20min6. 电泳（电泳液最多使用两次）1) 安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）2) 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）Mark 4l （Protern ladder）推荐 9，实际 4 已经足够 样品 8
5、l 7-10l 均可内参挑齐即可组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪3) 连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至 70mV，跑约 20min。（Mark 跑开，分出彩带即可）再调电压至 120mV，跑约 60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark 的条带从红色条带往下依次为：7055 403520，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡7. 转膜（转移液可用 3-4 次）1) 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与
6、胶一致大小（胶始终保持湿润）2) 剪 PVDF 膜（用上述滤纸，勿用手直接接触 PVDF 膜），然后用甲醇活化 10s 以上3) “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸胶膜两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）4) 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）5) 打开开关，调节电流至 100mA，转膜 2h（恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色8. 封闭1) 配制 5%脱脂奶粉：2.5g 脱脂奶粉50mlTBST小烧杯中混匀加入皿中2) 将膜取出放入上述加入了 5%
7、脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用 2 次）9. 一抗1) 用 TBST 配，每一格加 5ml TBST，再分别加入抗体抗体的量：2l（ Psmad2l）免抗 1:1000 5l：5ml 58（分子量）2l（ Psmad2l）免抗 1:500 10l：5ml 58Jnk 免抗 1:1000 5l：5ml 双带内参（小鼠抗 GAPH）单抗，中杉金桥1:5000 1l：5ml 362) 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）3) 4 冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床 416 室）10. 洗脱用 TBST 在皿中洗脱，摇床 10min 每次，洗三次。
8、11. 二抗1) 用 3%的脱脂奶粉1.5g 的脱脂奶粉50mlTBST2) 每格吸入 5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为 1:5000，即加入 1l注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3) 膜分别加入小格，慢摇 1-2h（常温）12. 洗脱用 TBST 在皿中洗脱，摇床 10min 每次，洗三次。小烧杯中混匀加入皿中13. 显影：U 盘A 液，B 液（显影液。4 保存）200l 枪+ 枪头（黄）膜（置于皿中）1) 开机后自动预冷，温度降到 1-20才可2) 显影液现配现用（A 液：B 液=1：1 ）3) 膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上4) 先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影 15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。5) 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至 U 盘试剂配方：所需物品
