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1、1非小细胞肺癌患者血清蛋白质标记物的检测作者：杨洋 赵松 王建军 刘东雷 朱登言【摘要 】 目的 检测非小细胞肺癌患者（NSCLC）血清蛋白质，筛选特异的蛋白质标记物，构建用于 NSCLC 早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型。方法 应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术检测 235 例血清标本的蛋白质质谱，并结合生物信息学方法(支持向量机) 分析数据。结果 筛选出 3 个质荷比(m/z)位于 6628，9191 和 11412 的蛋白质标记物，构建 NSCLC早期诊断模型。联合 3 种潜在蛋白质标记物，经留一法交叉验证，区分 NSCLC 和正常健康对照的敏感性为 98，
2、特异性为 96。盲法验证显示，该模型诊断 NSCLC 的敏感性为 96.56%，特异性为94.79%。结论 SELDITOFMS 结合支持向量机建立 NSCLC 血清蛋白质指纹图谱模型是早期诊断 NSCLC 的一种敏感性高、特异性强的新方法，值得进一步研究与应用。 【关键词】 非小细胞肺癌；诊断；支持向量机；生物标记物肺癌是当今世界上死亡率最高的肿瘤，大约占所有恶性肿瘤死亡人数的 25%1 。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌发病率的80%2 。早期诊断、及时合理的治疗对提高 NSCLC 患者长期生2存率及预后具有重要意义3 。现阶段临床上诊断 NSCLC 主要依靠胸部 X 线摄像、CT、细胞
3、穿刺学、支气管镜检查等，多数病例虽可确诊，但因未能及早发现而误失治疗时机影响预后4 。蛋白质组学的发展为 NSCLC 的早期诊断提供了新的思路和技术平台5 。本研究应用蛋白质组学的表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDITOFMS ）技术和生物信息学的方法检测 NSCLC 患者、肺部良性疾病患者及正常健康人的血清蛋白质组，筛选出特异的蛋白质标记物，探讨用于 NSCLC 早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型，同时评价该模型对 NSCLC 诊断的应用价值。1 对象与方法1.1 对象血清样本共 235 例，来自华中科技大学附属协和医院及郑州大学第一附属医院胸外科。其中 NSCLC 患者血清 112
4、例（鳞状上皮细胞癌 56 例，腺癌 45 例，未分化型大细胞癌 11 例） ，肺结核患者血清 25 例，肺炎患者血清 30 例，正常健康志愿者血清 68 例。本实验经本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。112 例NSCLC 患者（期 20 例，期 36 例， 期 37 例，期 19 例）中，男 78 例，女 34 例，中位年龄 59 岁。所有 NSCLC 均经 2 位病理专家证实。肺部良性疾病和正常健康组与 NSCLC 组年龄、性3别相匹配。外周静脉血标本均于清晨空腹时抽取，室温下静置 1 h后 3 000 r/min 离心 10 min，收集血清样本，储存于 -80保存备用。1.2
5、主要试剂和仪器33( 胆酰胺丙基 )二甲氨基丙磺酸内盐（ CHAPS）,尿素, 二硫苏糖醇（DTT）,醋酸钠缓冲液,芥子酸（SPA）均购自美国Sigma 公司。蛋白芯片生物系统（Ciphergen PBS + SELDITOFMS）和弱阳离子交换芯片 WCX2 均购自美国Ciphergen Biosystems 公司。1.3 蛋白芯片技术路线血清标本冰浴解冻，4 离心；取 96 孔板置冰盒上，每孔加U9（ 9 MUrea，2% CHAPS，1% DTT） 10 l,血清 5 l，4 层析柜 600 r/min 振荡 30 min。震荡结束前 15 min 做芯片预处理，芯片装入 Bioproc
6、essor 中，记录芯片号；每孔加醋酸钠 (100 mmol/L，pH4) 200 l，层析；U9 处理后的 96 孔板置冰上，排枪加醋酸钠 185 l，层析；取已处理的样本 100 l 加入到芯片上，层析，甩去残液，快速拍干。加醋酸钠 200 l，振荡，甩掉，拍干。200 l 去离子水 200 l 冲洗、甩干。芯片风干后，每孔分 2 次加4入 50%饱和 SPA 1 l,干燥后上机待测。1.4 数据收集与处理用已知分子量的蛋白芯片将 SELDITOFMS 系统校正到分子量误差0.1% 。将结合好蛋白质的 WCX2 蛋白质芯片用质谱阅读仪分析。分析参数：激光强度为 170，灵敏度为 6，每个样
7、本收集总点数 140 次。收集数据范围 1 00030 000，优化范围 2 000 20 000。以质控血清作重复性检测，其峰值大小和强度变异系数为 0.05%和 19.7%。所有数据用 Proteinchip Software 3.1 校正。蛋白芯片数据分析软件包分析，离散小波分析去除噪音，减掉基线。用局部极值的方法找出样本各自的峰，并过滤掉信噪比2的峰。以 10%为最小阈值做聚类分析，将各个样本中质荷比（m/z）差异0.3%的峰聚为一类。支持向量机分类器设置4：采用径向基核函数，Gamma值设为 0.6，罚分函数（ C）设为 19。特征向量的选择采用统计过滤结合模型依赖性筛选方法,建立判
8、别模型,用留一法交叉验证评估模型的判别效果。采用判别分析方法处理质谱数据并经统计学处理得到的结果进行验证。1.5 统计学方法5质谱原始数据经过滤噪音，聚类分析处理后，对初步筛选出的 M/Z 峰数据做 Wilconxon 秩和检验，并分别对 NSCLC 组与正常健康对照组及肺部良性疾病组的质谱数据进行 t 检验。检验标准取 =0.01。2 结果2.1 NSCLC 诊断模型的构建NSCLC 组（60 例）和正常健康对照组（40 例）的质谱数据经过初步过滤筛选得到 235 个 m/z 峰，对其相对强度做Wilconxon 秩和检验分析得到 P 值0.01 的 m/z 峰 22 个。从差异显著蛋白质峰
9、的任意组合中，采用支持向量机筛选出预测值的youden 指数最高的组合模型。筛出 m/z 位于 6628，9191 和11412 的蛋白标记物 3 个（表 1） ，其中 m/z 位于 6628 的蛋白质标记物在 NSCLC 组中低表达，在正常对照组中高表达；m/z 位于9191 和 11412 的蛋白标记物在 NSCLC 组中呈高表达，在正常对照组中低表达（图 1） 。联合两个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为 98%，敏感性为 96%。此外，6628 蛋白标记物的表达丰度随着肿瘤分期的增高而逐渐降低，9191 和 11412 的蛋白标记物的表达则随着肿瘤分期的
10、增高而逐渐6增加（图 2） 。表 1 NSCLC 患者组与正常健康对照组的 m/z 位于9191、6628 及 11412 的比较( 略)2.2 NSCLC 诊断模型的盲法验证为了验证上述诊断模型的准确性和有效性，本研究采用 52例 NSCLC 血清标本及非肺癌血清标本（25 例肺结核、30 例肺炎患者及 28 例正常健康人）进行盲法验证。在盲法测试中，该诊断模型区分 NSCLC 患者与非肺癌对照的敏感性为 96.56%，特异性为94.79%，阳性预测值为 95.0%。3 讨论目前对恶性肿瘤蛋白质标记物的检测已受到高度关注，蛋白质标记物的检测技术很可能成为未来肿瘤诊断的主要手段。Cipherg
11、en 公司研发的 SELDITOFMS 技术是近几年来用的比较广泛的一项蛋白质组学技术，应用基因芯片的设计原理，把层析、质谱等技术合理的与蛋白质芯片结合，可检测出传统方法很难鉴定的蛋白质和多肽。这一方法具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点68 ，已成功被应用于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤的诊断、肿瘤标记物的筛选及其他蛋白质组学研究中9 13 。然而通过这一方法获得的大量数据是传统数据收集手段所难以完成的，因此在数据处理中就客观的需要7生物信息学技术的参与。支持向量机(SVM)是 Vapnik 等提出的一种以统计学理论为基础的新的机器学习方法。通过学习算法，SV
12、M 可以自动寻找出那些对分类有较好区分能力的支持向量，优于决策树及人工神经网络等传统方法，有较好的适应能力和较高的分准率。很好地解决了模式识别中小样本模型的推广性、模型选择等问题14，15 。本实验数据处理中，通过离散小波分析去除噪音，用局部极值的方法找出样本质荷峰，以 10为最小阈值对质荷峰进行聚类。 Wilconxon秩和检验分析根据 P 值评价各个峰对区分两类样本的相对重要性。将差异显著的质荷峰随机组合输入 SVM，筛选标记物，建立判别模型。用留一法交叉验证评估模型。因每次的测试集都是独立于用来训练的样本，完全做到盲法测试。经过以上多步骤、结合多种方法处理数据，确保了所建模型的推广性和预
13、测的准确性。本实验应用 SELDITOFMS 技术结合生物信息学方法，发现了 NSCLC 患者血清中可与正常健康人、肺部良性疾病区分的特异性蛋白质标记物，检测该蛋白质标记物有利于 NSCLC 的早期诊断。在 NSCLC 组与正常对照组中，发现 m/z 值为 6628，9191 和11412 处 3 个峰的同时变化在 NSCLC 组和正常对照组中具有明确的诊断意义。m/z 位于 6628 的蛋白质标记物在 NSCLC 患者组中低表达，在正常对照组中高表达；m/z 位于 9191，11412 的蛋白8标记物在 NSCLC 组中高表达，在正常对照组中低表达，特异性为98%，敏感性为 96%。为了验证
14、上述诊断模型的准确性和有效性，又进行了盲法验证。在盲法测试中，该诊断模型区分 NSCLC 患者与非肺癌对照的敏感性为 96.56%，特异性为 94.79%，阳性预测值为 95.0%，显示出该诊断模型在大规模筛查、 NSCLC 的鉴别诊断及定性诊断中具有良好的应用前景。本实验构建的诊断模型经测试显示了其优越的诊断价值，为 NSCLC 的早期诊断提供了新方法，值得进一步的研究与应用。【参考文献】1 Youlden DR，Cramb SM，Baade PD.The international epidemiology of lung cancer：geographical distribution
15、and secular trendsJ.J Thorac Oncol,2008；3(8)：81931.2 Molina JR，Yang P，Cassivi SD,et al.Nonsmall cell lung cancer：epidemiology ，risk factors，treatment，and survivorshipJ.Mayo Clin Pro,2008；83(5)：58494.3 Mulshine JL，Sullivan DC.Clinical practice.Lung cancer screeningJ.N Engl J Med，2005；352(26)：271420.9
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