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1、在专门的引物设计软件中 , “ Oli go” 是最著名的 。 它的使用并不十分复杂 , 但初学者容易被其复杂的图表吓倒 。 Ol igo 5.0 的初始界面是两个图 : Tm 图和 G 图 ; Ol igo 6.0 的界面更复杂 , 出现三个图 , 加了个 Fr q 图 。“Oli go”的功能比 “Pr em ier ” 还要单一,就是引物设计。但它的引物 分析 功能如此强大以至于能风靡全世界 。oli go的下载和安装我就不多说了,打开 oli go 相信也无需多讲。打开 oli go的页面如下:单击 f il e 菜单再点 open 或点击 “ 打开 ”快捷图标或者用快捷键 “CTr
2、l O”可打开下面的窗口在打开的 OPEN 窗口内选择 Fr eqSeq 再点 “打开 ”选择 drosfr 或者其它一个文件点击 “打开 ”出现以下窗口,点击 “window”再点击 “Tile ”出现以下窗口 , 图中显示的三个指标分别为 Tm 、 G 和 Fr q, 其中 Fr q 是 6.0 版本的新功能 , 为邻近 6 至 7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率 。 该频率高则可增加错误引发的可能性 。 因为分析要涉及 多个指标,起动窗 口的 c asc ade排列方式 不太方便,可从 windows 菜单改为 t il e 方式。如 果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如
3、Fr q,这样界面的结构同于 Ol igo5.0,只是显示更清楚了。G 值反映了序列与模板的结合强度 , 最好引物的 G 值在 5 端和中间值比较高 , 而在 3 端相对低(如图:)Tm 值曲线以选取 72 附近为佳 , 5 到 3 的下降形状也有利于引物引发聚合反应 。 Fr q 曲线为 “Oli go6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用 3 端 Fr q 值相对较低的片段 。再点击 Sear c h 再点 “For Pr im er s andprobes” 或使用快捷键 F3出现以下窗口 , 点 OK 就 OK 了 。 当然你也可以点击 “ Pr a
4、m et er s ”和 “Sear c h Range” 选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。出现 Sear c h St at us窗口,点 “ OK”出现 Pr im er pai r s 窗口, 代表引物对的编 号,依次为引物对 所处的位置、产 物的长度、最适合 的退火温度、和 GC 的百分含量点击任一行出现 “ PCR” 窗口,告知你扩增片断的位置,最合适的退火温度等等信息。关掉 “PCR 窗口 ”和 “prim er Pair s 窗口 ”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置 , 图中手型鼠标所指即为引物序列。至此引物设计已经完成,你可以用 “Anal ys
5、e”菜单分析你的引物:有无引物二聚体、发卡结构等等。当上下游引物全选好以后 , 需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改 。 首先检查引物二聚体尤其 是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游 引物之间形 成( c ross dim er ) 。二聚 体形成的能 值越高,越 不符合要求 。一般的检 测(非克隆 ) 性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构 ( hai r pin ) ; 与二聚体相同 , 发夹结构的能值越低越好 。 一般来说 , 这两项结构的能值以不超
6、过 4.5 为好。当然,在设计克隆目的的 PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构 ,而且能值不会太低 。 这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果 , 对引物的发夹结构的检测就不应要求太高 。 第三项检查为 GC 含量 , 以 45-55为宜 。 有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高 , 导致引物的 GC 含量不能被控制在 上述范围内,这时应尽量使上下游 引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近,以有 利于退火温度的选择。好了, oli go使用的简单介绍到此结束。在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能,操作如下1,点击 Fil e 菜单中的 New 命
7、令;2,在 “Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物;3,如果该引物的首位置不是 1 的话,可以在 “Edit ”窗口中输入新的 5端位置数字,如 20;4,点击 Ac cept/ Dis c ar d 菜单的 Ac cept 命令;5,如果引物序列长度不同于当前的引物的话,可以从 “Change”菜单中改变当前的引物长度;6,选取当前序列为上游引物(点击 “upper ”按钮 ) ;7,从 Edit 菜单中选取 “Lower Pr im er ”命令,在 Edit Lower 窗口中输入下游引物的序列;8,在 Edit 窗口的上角处,输入相应的 5 位置;9, 选取
8、“Ac c ept andQuit ”命令 ; 如果想让程序给出最佳退火温度 , 在此时的对话框中输入 PCR 产物的长度以及 GC 含量所占百分比,一般哺乳动物的 cDNA 序列中 GC 大约占 44。10,点击 OK 就可以在 “Anal yze ”菜单中完成各种分析了。关于引物的评价有几点:1、 duple x f orm at ion: 这是评价引物二聚体形成的 , 包括自身形成二聚体和引物间二聚体 , 主要是看引物 3 端有无配对碱基 (最好没有 ) 。 其中的 c urr ent oli go 是当你对引物进行了编辑 ( 如加入酶切位点 ) 时 , 对原始引物进行的分析 。 (下同
9、)形成的二 聚体要看能值 G( 得它不会输入啊! ) ,能值越低越好, 最好不要超过 4.5(下同)2、 hair pin f orm at ion: 是看引物自身能否形成发夹结构,主要也是看 3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值, 不超过 4.5。如果引物中加 入酶切位点,可能会有发夹结构且 能值不会太低,这就需要灵活控制退火温度了。3、 composit ion andTm : 分析上下游引物的碱基组成, GC 比和 Tm 值,原则我就不多说了。4、 f als e prim i ng s it e: 如果模板不是基 因组 DNA,而是一个特定 模板序列,需要进行错配的分析, 看你的引物 ( 尤其 3端 ) 是否与特定模板的其他位点结合 。 一般错配的引发效率以不超过 100为好 , 但并不绝对 ,如果正确结合位点的引发效率为 450以上 , 而有一个错配的引发效率是 120左右的 , 这个引物也是可以接受地 ! !5、 PCR: 总结性的显示引物位置 , 产物大小 , Tm 值等参数 , 你可以横向比较一下 , 尤其是给了一个 optim alanneal i ngt em 还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。引物主要的评价功能也就这些了,应付一些基本的引物分析足够了。