oligo的使用

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1、在专门的引物设计软件中 ， “ Oli go” 是最著名的 。 它的使用并不十分复杂 ， 但初学者容易被其复杂的图表吓倒 。 Ol igo 5.0 的初始界面是两个图 ： Tm 图和 G 图 ； Ol igo 6.0 的界面更复杂 ， 出现三个图 ， 加了个 Fr q 图 。“Oli go”的功能比 “Pr em ier ” 还要单一，就是引物设计。但它的引物 分析 功能如此强大以至于能风靡全世界 。oli go的下载和安装我就不多说了，打开 oli go 相信也无需多讲。打开 oli go的页面如下：单击 f il e 菜单再点 open 或点击 “ 打开 ”快捷图标或者用快捷键 “CTr

2、l O”可打开下面的窗口在打开的 OPEN 窗口内选择 Fr eqSeq 再点 “打开 ”选择 drosfr 或者其它一个文件点击 “打开 ”出现以下窗口，点击 “window”再点击 “Tile ”出现以下窗口 ， 图中显示的三个指标分别为 Tm 、 G 和 Fr q， 其中 Fr q 是 6.0 版本的新功能 ， 为邻近 6 至 7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率 。 该频率高则可增加错误引发的可能性 。 因为分析要涉及 多个指标，起动窗 口的 c asc ade排列方式 不太方便，可从 windows 菜单改为 t il e 方式。如 果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如

3、Fr q，这样界面的结构同于 Ol igo5.0，只是显示更清楚了。G 值反映了序列与模板的结合强度 ， 最好引物的 G 值在 5 端和中间值比较高 ， 而在 3 端相对低（如图：）Tm 值曲线以选取 72 附近为佳 ， 5 到 3 的下降形状也有利于引物引发聚合反应 。 Fr q 曲线为 “Oli go6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 3 端 Fr q 值相对较低的片段 。再点击 Sear c h 再点 “For Pr im er s andprobes” 或使用快捷键 F3出现以下窗口 ， 点 OK 就 OK 了 。 当然你也可以点击 “ Pr a

4、m et er s ”和 “Sear c h Range” 选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。出现 Sear c h St at us窗口，点 “ OK”出现 Pr im er pai r s 窗口， 代表引物对的编 号，依次为引物对 所处的位置、产 物的长度、最适合 的退火温度、和 GC 的百分含量点击任一行出现 “ PCR” 窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。关掉 “PCR 窗口 ”和 “prim er Pair s 窗口 ”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置 ， 图中手型鼠标所指即为引物序列。至此引物设计已经完成，你可以用 “Anal ys

5、e”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。当上下游引物全选好以后 ， 需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改 。 首先检查引物二聚体尤其 是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游 引物之间形 成（ c ross dim er ） 。二聚 体形成的能 值越高，越 不符合要求 。一般的检 测（非克隆 ） 性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构 （ hai r pin ） ； 与二聚体相同 ， 发夹结构的能值越低越好 。 一般来说 ， 这两项结构的能值以不超

6、过 4.5 为好。当然，在设计克隆目的的 PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构 ，而且能值不会太低 。 这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果 ， 对引物的发夹结构的检测就不应要求太高 。 第三项检查为 GC 含量 ， 以 45-55为宜 。 有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高 ， 导致引物的 GC 含量不能被控制在 上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近，以有 利于退火温度的选择。好了， oli go使用的简单介绍到此结束。在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能，操作如下1，点击 Fil e 菜单中的 New 命

7、令；2，在 “Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；3，如果该引物的首位置不是 1 的话，可以在 “Edit ”窗口中输入新的 5端位置数字，如 20；4，点击 Ac cept/ Dis c ar d 菜单的 Ac cept 命令；5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从 “Change”菜单中改变当前的引物长度；6，选取当前序列为上游引物（点击 “upper ”按钮 ） ；7，从 Edit 菜单中选取 “Lower Pr im er ”命令，在 Edit Lower 窗口中输入下游引物的序列；8，在 Edit 窗口的上角处，输入相应的 5 位置；9， 选取

8、“Ac c ept andQuit ”命令 ； 如果想让程序给出最佳退火温度 ， 在此时的对话框中输入 PCR 产物的长度以及 GC 含量所占百分比，一般哺乳动物的 cDNA 序列中 GC 大约占 44。10，点击 OK 就可以在 “Anal yze ”菜单中完成各种分析了。关于引物的评价有几点：1、 duple x f orm at ion: 这是评价引物二聚体形成的 ， 包括自身形成二聚体和引物间二聚体 ， 主要是看引物 3 端有无配对碱基 (最好没有 ) 。 其中的 c urr ent oli go 是当你对引物进行了编辑 （ 如加入酶切位点 ） 时 ， 对原始引物进行的分析 。 （下同

9、）形成的二 聚体要看能值 G( 得它不会输入啊！ ) ，能值越低越好， 最好不要超过 4.5（下同）2、 hair pin f orm at ion: 是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看 3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值， 不超过 4.5。如果引物中加 入酶切位点，可能会有发夹结构且 能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。3、 composit ion andTm : 分析上下游引物的碱基组成， GC 比和 Tm 值，原则我就不多说了。4、 f als e prim i ng s it e: 如果模板不是基 因组 DNA，而是一个特定 模板序列，需要进行错配的分析， 看你的引物 （ 尤其 3端 ） 是否与特定模板的其他位点结合 。 一般错配的引发效率以不超过 100为好 ， 但并不绝对 ，如果正确结合位点的引发效率为 450以上 ， 而有一个错配的引发效率是 120左右的 ， 这个引物也是可以接受地 ！ ！5、 PCR： 总结性的显示引物位置 ， 产物大小 ， Tm 值等参数 ， 你可以横向比较一下 ， 尤其是给了一个 optim alanneal i ngt em 还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。引物主要的评价功能也就这些了，应付一些基本的引物分析足够了。