《临床病例中病原性细菌的分离与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床病例中病原性细菌的分离与鉴定（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实践五 临床病例中病原性细菌的分离与鉴定目的要求初步掌握动物疫病检测的采样技术、病原微生物的接种、分离、培养、纯化技术及鉴定技术练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。实验原理为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离实验材料样品：临床病例培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、肉汤培养基、三糖铁培养基。无菌水：装有 45mL 无菌水三角瓶、装有 9mL 无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌
2、吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。试剂：1 万 U/mL 链霉素液、10苯酚；剪刀，镊子，手术刀，冰块，保温盒，酒精灯实验步骤(一)动物疫病检测的采样技术：重大动物疫病检测中，结果准确与否，样品质量是关键，因此采样人员必须是兽医技术人员，熟悉采样器具的使用，掌握正确采样方法，科学采样采样时注意隔离防护，隔离或防护服进出场要消毒，准备好采样所需的器具家禽采样需要：酒精棉、碘酒棉、5ml 注射器、无菌棉签、塑料离心管、签字笔、记号笔、采样单等牛羊采样还需：牛鼻钳、20ml 注射器、采血真空管、采样杯、 OP 液保存容器等猪采样还需：猪保定器、开口器、扁桃体采样器等脏器的采
3、取还需：解剖刀、齿锯、剪刀、手术刀、镊子、病料保存袋等所有病原检测样品都需冷藏箱加冰块保存和运输血清样品的采集家畜采血方法：雏鸡（禽）心脏采血左手抓鸡，竖折，手持采血针，平行颈椎。从胸腔前口插入，回抽风有回稳中有降时，即把针心向外拉，使血液流入采血针成年禽心脏采血助手抓住两翅及两腿，右侧握保定，在触及心博动明显处或胸骨前端，背部下部凹处连线的 1/2 入消毒，垂直或稍向前方刺入 2-3cm，回抽见回血时，即把针心各外拉，使血液流入洒血针成年禽可采取翅静脉采血助手一手握住禽的两腿，另一手握住两翼，在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向静脉丛刺入，见有血液回流即把针心向外拉，使血液流入采血针，
4、每只禽采血液 2-3ml 做好标记牛羊采血方法牛颈静脉采血用手按住颈静脉沟的下端及近心端，可看到颈静脉隆起，消毒后在颈静脉隆起处，针头向头端方向快速刺入，抽取 5ml 血，采血完毕用酒精棉球按压并拔出针头也可采用尾静脉采血在牛尾根后下方 4-5cm 的正中，垂直刺入 2-3cm，见有血液回流进入真空采血管奶牛可乳房静脉采血奶牛腹部可看到明显隆起的乳房静脉，消毒后在静脉隆起处，针头向后肢方向快速刺入，见有血液回流进入真空采血管羊的采血方法：选用颈静脉采血，方法同牛颈静脉采血猪的采血方法耳静脉采血：站立保定，助手用力在耳根压静脉的近心端，手指轻弹或用酒精棉 球反复涂擦耳静脉，使血管扩张，针头沿血管
5、刺入，见有血液回流接入真空采血管前腔静脉采血：保定器让猪头仰起，露出右腋窝，针头从右侧向心脏方向刺入，回抽见有回血时，即把针心向外拉，使血液流入采血真空管血清分离：采血后针心后拉抽入少量空气，倾向放置，血液凝固前不能晃动以防止溶血，血液经过自然放置数小时，冬天可置 37恒温箱中 1 小时左右，见上面析出淡黄色液体即为血清，将血清移到另外的小塑料离心管中，盖紧瓶盖，做好标记，每份血清量不少于 0.5ml病原检测样品的采集1、家禽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法取无菌棉签插入鸡喉咙内转动三圈或泄殖腔内转动三圈取出，插入含有 1ml 含青霉素、链霉素各 3000 单位的 PH 值为 7.2 的 pb 离心
6、管中，减去漏出部分，盖紧瓶盖，做好标记2、牛羊 O-P 液的采取方法：先禁食 12 小时，助手保定牛，消毒碳杯，术者手从牛喉角后沿伸入口腔，抓住舌头，将碳杯送入咽喉，顺吞咽动作将采样杯来回抽动三次即可。将 O-P 液移入容器或汉克式（Hanks）液中保存。3、猪扁桃体采取技术扁桃体采样器使用：把采样钩拉在扁桃体上，快速扣动板机即可扁桃体采集：用开口器开口，可以看到突起的扁桃体，快速扣动板机取出扁桃体放离心管中病死畜禽的解剖与重大动物疫病检测中，结果准确与否，样品质量是关键，因此采样人员必须是兽医技术人员，熟悉采样器具的使用，掌握正确采样方法，科学采样采样时注意隔离防护，隔离或防护服进出场要消毒
7、，准备好采样所需的器具家禽采样需要：酒精棉、碘酒棉、5ml 注射器、无菌棉签、塑料离心管、签字笔、记号笔、采样单等牛羊采样还需：牛鼻钳、20ml 注射器、采血真空管、采样杯、 OP 液保存容器等猪采样还需：猪保定器、开口器、扁桃体采样器等脏器的采取还需：解剖刀、齿锯、剪刀、手术刀、镊子、病料保存袋等所有病原检测样品都需冷藏箱加冰块保存和运输血清样品的采集家畜采血方法：雏鸡（禽）心脏采血左手抓鸡，竖折，手持采血针，平行颈椎。从胸腔前口插入，回抽风有回稳中有降时，即把针心向外拉，使血液流入采血针成年禽心脏采血助手抓住两翅及两腿，右侧握保定，在触及心博动明显处或胸骨前端，背部下部凹处连线的 1/2
8、入消毒，垂直或稍向前方刺入 2-3cm，回抽见回血时，即把针心各外拉，使血液流入洒血针成年禽可采取翅静脉采血助手一手握住禽的两腿，另一手握住两翼，在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向静脉丛刺入，见有血液回流即把针心向外拉，使血液流入采血针，每只禽采血液 2-3ml 做好标记牛羊采血方法牛颈静脉采血用手按住颈静脉沟的下端及近心端，可看到颈静脉隆起，消毒后在颈静脉隆起处，针头向头端方向快速刺入，抽取 5ml 血，采血完毕用酒精棉球按压并拔出针头也可采用尾静脉采血在牛尾根后下方 4-5cm 的正中，垂直刺入 2-3cm，见有血液回流进入真空采血管奶牛可乳房静脉采血奶牛腹部可看到明显隆起的乳房静
9、脉，消毒后在静脉隆起处，针头向后肢方向快速刺入，见有血液回流进入真空采血管羊的采血方法：选用颈静脉采血，方法同牛颈静脉采血猪的采血方法1、 耳静脉采血：站立保定，助手用力在耳根压静脉的近心端，手指轻弹或用酒精棉 球反复涂擦耳静脉，使血管扩张，针头沿血管刺入，见有血液回流接入真空采血管2、 前腔静脉采血：保定器让猪头仰起，露出右腋窝，针头从右侧向心脏方向刺入，回抽见有回血时，即把针心向外拉，使血液流入采血真空管血清分离：采血后针心后拉抽入少量空气，倾向放置，血液凝固前不能晃动以防止溶血，血液经过自然放置数小时，冬天可置 37恒温箱中 1 小时左右，见上面析出淡黄色液体即为血清，将血清移到另外的小
10、塑料离心管中，盖紧瓶盖，做好标记，每份血清量不少于 0.5ml病原检测样品的采集1、家禽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法取无菌棉签插入鸡喉咙内转动三圈或泄殖腔内转动三圈取出，插入含有 1ml 含青霉素、链霉素各 3000 单位的 PH 值为 7.2 的 pb 离心管中，减去漏出部分，盖紧瓶盖，做好标记2、牛羊 O-P 液的采取方法：先禁食 12 小时，助手保定牛，消毒碳杯，术者手从牛喉角后沿伸入口腔，抓住舌头，将碳杯送入咽喉，顺吞咽动作将采样杯来回抽动三次即可。将 O-P 液移入容器或汉克式（Hanks）液中保存。3、猪扁桃体采取技术扁桃体采样器使用：把采样钩拉在扁桃体上，快速扣动板机即可扁桃体采集
11、：用开口器开口，可以看到突起的扁桃体，快速扣动板机取出扁桃体放离心管中病死畜禽的解剖与病变组织器官的采取采样原则：采集有病变的器官组织，采集病变和健康组织交界处，先采实质器官，如脾、肾，后采集污染的器官组织，如胃肠等。急性死亡的牛羊先采耳尖血,涂片镜检，排除炭疽。1、 猪的样品采集活猪先从前腔静脉采血，病死猪沿腹部切开并剥离皮肤，然后酒精棉火焰消毒，更换手套、镊子、剪刀，观察并采集股前淋巴结，下颌淋巴结，然后剪开胸骨，打开胸腹腔，观察心、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、扁桃体、喉头、膀胱、胃、小肠、大肠等器官的病变并采样，如有神经症状，还要采集大脑，用锯锯开脑骨，剪刀剥离脑膜，用镊子取出大脑。2、 家
12、禽的样品采集先用消毒剂喷湿鸡毛，从两腿到胸部用剪刀剪开，剥离皮肤，用酒精棉火焰消毒，更换手套、镊子、剪刀、沿肋骨下缘剪开，观察肝脏并取样，然后检查心脏、肺脏、脾脏、喉气管、脾胃、肌胃、十二指肠、胰腺、肓肠与盲肠扁桃体、直肠等器官的病变并取样，采样完毕脱掉手套与病禽尸体一起进行无害化处理.采样人员用消毒液洗手消毒，环境采用喷洒消毒，所采病料放带有冰块的冷藏箱保存运送,如不能及时运送或检测，1-3 天血清样品可冷藏保存，否则冰冻保存，病料样品冰冻保存期，作细菌培养的样品应冷藏保存和运送，采样同时填写采样单，包括厂名、畜种、日龄、联系人、变化、规模、采样数量、样品名称、编号、免疫情况、临床表现、病理
13、变化等。 （采样单用签字笔或钢笔逐项详细填写，一式三份）采样时间与数量：免疫效果检测：冻干疫苗免疫 14 天，灭活疫苗免疫 21 天后，每群采血清 30 份，进行抗体水平检测。疫苗监测：采集禽喉拭子和泄殖腔拭子，牛 O-P 液，猪扁桃体进行病原监测。采样数量依据感染的高低，一般可每群随机抽检 30-60 头（只） ，有病死时，可采 2-3 头（只）病死畜禽的器官组织。病变组织器官的采取采样原则：采集有病变的器官组织，采集病变和健康组织交界处，先采实质器官，如脾、肾，后采集污染的器官组织，如胃肠等。急性死亡的牛羊先采耳尖血,涂片镜检，排除炭疽。猪的样品采集活猪先从前腔静脉采血，病死猪沿腹部切开并
14、剥离皮肤，然后酒精棉火焰消毒，更换手套、镊子、剪刀，观察并采集股前淋巴结，下颌淋巴结，然后剪开胸骨，打开胸腹腔，观察心、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、扁桃体、喉头、膀胱、胃、小肠、大肠等器官的病变并采样，如有神经症状，还要采集大脑，用锯锯开脑骨，剪刀剥离脑膜，用镊子取出大脑。家禽的样品采集先用消毒剂喷湿鸡毛，从两腿到胸部用剪刀剪开，剥离皮肤，用酒精棉火焰消毒，更换手套、镊子、剪刀、沿肋骨下缘剪开，观察肝脏并取样，然后检查心脏、肺脏、脾脏、喉气管、脾胃、肌胃、十二指肠、胰腺、肓肠与盲肠扁桃体、直肠等器官的病变并取样，采样完毕脱掉手套与病禽尸体一起进行无害化处理采样人员用消毒液洗手消毒，环境采用喷洒消毒
15、，所采病料放带有冰块的冷藏箱保存运送如不能及时运送或检测，1-3 天血清样品可冷藏保存，否则冰冻保存，病料样品冰冻保存期，作细菌培养的样品应冷藏保存和运送，采样同时填写采样单，包括厂名、畜种、日龄、联系人、变化、规模、采样数量、样品名称、编号、免疫情况、临床表现、病理变化等。 （采样单用签字笔或钢笔逐项详细填写，一式三份）采样时间与数量：1、 免疫效果检测：冻干疫苗免疫 14 天，灭活疫苗免疫 21 天后，每群采血清 30 份，进行抗体水平检测。2、 疫苗监测：采集禽喉拭子和泄殖腔拭子，牛 O-P 液，猪扁桃体进行病原监测。采样数量依据感染的高低，一般可每群随机抽检 30-60 头（只） ，有病死时，可采 2-3头（只）病死畜禽的器官组织。（二）分离微生物菌检测程序1、菌落总数的检验程序如下 检 样 做成几个适当倍数的稀释液 选择 23 个适宜稀释度 各以 1mL 分别加入灭菌平皿内 每皿内加入适量营养琼脂 361 482h 菌落计数 报 告 2、 大肠菌群操作程序 检样 稀释 乳糖胆盐发酵管 36 1 ,242h
