《RACE原理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RACE原理（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、RACERACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是 通 过 PCR 进 行 cDNA 末 端 快 速克 隆 的 技 术 。cDNA 完 整 序 列 的 获 得 对 基 因 结 构 、 蛋 白 质 表 达 、 基 因 功 能 的 研 究 至 关 重 要 。 完 整 的 cDNA 序 列 可 以 通 过 文 库 的 筛 选 和 末 端 克 隆 技 术 获 得 。 近 年 来 随 着 生 物 技 术 的 不 断 发 展 ， 出 现 了 许 多 新 基 因 的 方 法 和 手 段 ， 如 图 谱 技 术 、转 座 子 标 签 技 术 、 mRNA 差 异 显 示 技
2、术 二 减 法 技 术 以 及 cDNA 文 库 筛 选 技 术 等 。 但上 述 方 法 人 多 具 有 实 验 周 期 长 、 技 术 步 骤 烦 琐 且 工 作 量 大 等 特 点 。 cDNA 末 端 快 速 扩增 技 术 (rapid amplification of cDNA ends, RACE)是 一 种 基 于 PCR 从 低 丰 度 的 转录 本 中 快 速 扩 增 cDNA 的 5和 3末 端 的 有 效 方 法 ， 以 其 简 单 、 快 速 、 廉 价 等 优 势 而 受到 越 来 越 多 的 重 视 。经 典 的 RACE 技 术 是 由 Frohman 等 (19
3、88)发 明 的 一 项 技 术 ， 主 要 通 过 RT-PCR技 术 由 已 知 部 分 cDNA 序 列 来 得 到 完 整 的 cDNA5和 3端 ， 包 括 单 边 PCR 和 锚 定 PCR。 该 技 术 提 出 以 来 经 过 不 断 发 展 和 完 善 ， 克 服 了 早 期 技 术 步 骤 多 、 时 间 长 、 特 异 性差 的 缺 点 (Frohman 等 ,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova 等 ,1998: Matz等 11999)。 对 传 统 RACE 技 术 的 改 进 主 要 是 引 物 设 计 及 RT-PCR
4、技 术 的 改 进 :改 进之 一 是 利 用 锁 定 引 物 (lock docking primer)合 成 第 一 链 cDNA,即 在 oligo(dT)引 物 的3端 引 入 两 个 简 并 的 核 苷 酸 【 5-Oligo(dT)16_30MN-3, M=A/G/C;N=A/G/C/T】 ， 使引 物 定 位 在 poly(A)尾 的 起 始 点 ， 从 而 消 除 了 在 合 成 第 一 条 cDNA 链 时 oligo(dT)与 poly(A)尾 的 任 何 部 位 的 结 合 所 带 来 的 影 响 ;改 进 之 二 是 在 5端 加 尾 时 ， 采 用 poly(C)，而
5、 不 是 poly(A);改 进 之 三 是 采 用 RNase H 一 莫 洛 尼 氏 鼠 白 血 .病 毒 (MMLV)反 转 录 酶或 选 择 嗜 热 DNA 聚 合 酶 可 能 在 高 温 h (60 度 -70 度 )有 效 地 逆 转 录 mRNA， 从 而消 除 了 5端 由 于 高 CC 含 量 导 致 的 mRNA 二 级 结 构 对 逆 转 录 的 影 响 ;改 进 之 四 是 采 用热 启 动 PCR (hot start PCR)技 术 和 降 落 PCR(touch down PCR)提 高 PCR 反 应 的特 异 性 。 随 着 RACE 技 术 日 益 完 善
6、， 目 前 己 有 商 业 化 RACE 技 术 产 品 推 出 ， 如 CLONTECH 的 MarathoTM 技 术 和 SMART TM RACE 技 术 术 。 邢 桂 春 等 (2001)先 后 使 用 上述 两 种 盒 进 行 RACE 反 应 ， 结 果 发 现 使 用 Marathon TM 所 得 到 的 片 断 总 是 比 采 用SMARTsupTMRACE 盒 到 所 得 到 的 片 断 短 。 其 原 因 在 于 Marathon TM 技 术 反 转 录反 应 往 往 不 能 真 正 达 到 mRNA 的 5末 端 。 所 以 认 为 ， 进 行 RACE 反 应
7、应 当 优 选 SMARTTM RACE 盒 。 以 下 就 国 内 目 前 应 用 最 广 的 SMART TM RACE 盒 为 例 ， 简 要概 述 RACE 技 术 的 原 理 和 操 作 过 程 。 SMARTTM 3-RACE 的 原 理 是 :利 用 mRNA的 3末 端 的 poly(A)尾 巴 作 为 一 个 引 物 结 合 位 点 ， 以 连 有 SMART 寡 核 营 酸 序 列 通 用接 头 引 物 的 Oligo(dT)30MN 作 为 锁 定 引 物 反 转 录 合 成 标 准 第 一 链 cDNA。 然 后 用 一个 基 因 特 异 引 物 GSP1(gene s
8、pecific primer,GSP)作 为 上 游 引 物 ， 用 一 个 含 有 部 分接 头 序 列 的 通 用 引 物 UPM(universal primer,UPM)作 为 下 游 引 物 ， 以 cDNA 第 一 链为 模 板 ， 进 行 PCR 循 环 ， 把 目 的 基 因 3末 端 的 DNA 片 段 扩 增 出 来 。 RACE 的 优 点 与 筛 库 法 相 比 较 ， 有 许 多 方 面 的 优 点 1） 此 方 法 是 通 过 PCR 技 术 实 现 的 ， 无 须 建 立 cDNA 文 库 ， 可 以 在 很 短 的 时 间 内获 得 有 利 用 价 值 的 信
9、息 。 2） 节 约 了 实 验 所 花 费 的 经 费 和 时 间 。 3） 只 要 引 物 设 计 正 确 ， 在 初 级 产 物 的 基 础 上 可 以 获 得 大 量 的 感 兴 趣 基 因 的 全 长 。 实 验 室 现 有 的 RACE 试 剂 盒 的 简 介 RACE 是 一 种 从 一 个 相 同 的 cDNA 模 板 进 行 5和 3末 端 快 速 克 隆 的 方 法 。 此 方法 会 产 生 较 少 的 错 误 条 带 。 此 过 程 中 使 用 的 酶 混 合 物 非 常 适 合 长 链 PCR。 使 用 此 方 法 的 要 求 是 必 须 知 道 至 少 23 28 个
10、 核 苷 酸 序 列 信 息 ， 以 此 来 设 计 5末 端 和 3末 端 RACE 反 应 的 基 因 特 异 性 引 物 （ GSPs） 。 RACE 引 物 的 设 计 ： 基 因 特 异 性 引 物 （ GSPs） 应 该 是 ： 23 28nt 50 70 GC Tm 值 65 度 ， Tm 值 70 度 可 以 获 得 好 的 结 果 需 要 实 验 者 根 据 已 有 的 基 因 序 列 设 计 5和 3RACE 反 应 的 基 因 特 异 性 引 物 （ GSP1 和 GSP2).由 于 两 个 引 物 的 存 在 ， PCR 的 产 物 是 特 异 性 的 。 反 应 中
11、涉 及 到 的 一 些 事 项 cDNA 的 合 成 起 始 于 polyA+RNA。 如 果 使 用 其 它 的 基 因 组 DNA 或 总 RNA， 背景 会 很 高 。 RACE PCR 的 效 率 还 取 决 于 总 的 mRNA 中 目 的 mRNA 的 量 和 不 同 的 引 物 有 不同 的 退 火 和 延 伸 温 度 。 在 进 行 5和 3RACE PCR 的 时 候 应 该 使 用 热 启 动 。 表 4 中 给 出 了 所 有 引 物 的 相 互 关 系 。 重 叠 引 物 的 设 计 会 对 全 长 的 产 生 有 帮 助 。 另外 ， 重 叠 的 引 物 可 以 为
12、PCR 反 应 提 供 一 个 对 照 。 并 不 是 绝 对 的 要 利 用 设 计 的 引 物 产 生重 叠 片 段 。 引 物 GSP 中 的 GC 含 量 要 在 50 70 之 间 。 这 样 可 以 使 用 降 落 PCR。 避 免使 用 自 身 互 补 性 的 引 物 序 列 ， 否 则 会 产 生 回 折 和 形 成 分 子 内 氢 键 。 另 外 ， 避 免 使 用 与 AP1 互 补 的 引 物 ， 尤 其 是 在 3末 端 。 如 果 要 用 重 叠 片 段 来 检 测 设 计 的 引 物 ， GSp1 和 GSp2 之 间 至 少 是 100 200 碱基 。 只 有
13、这 样 才 可 以 用 扩 增 的 产 物 来 鉴 定 设 计 的 引 物 是 否 正 确 。 降 落 PCR 可 以 明 显 的 增 加 RACE PCR 产 物 的 特 异 性 。 在 最 开 始 的 循 环 中 ， 退火 温 度 高 于 AP1 引 物 的 Tm 值 ， 可 以 增 加 对 特 异 性 条 带 的 扩 增 。 随 后 的 退 火 和 延 伸 的温 度 降 回 到 AP1 的 温 度 ， 可 以 进 行 随 后 的 PCR 循 环 。 验 证 基 因 特 异 性 引 物 的 对 照 ： 单 个 引 物 的 阴 性 对 照 ： 只 用 一 个 引 物 GSP 来 进 行 阴
14、性 对 照 。 这 样 不 应 该 产 生 任何 的 条 带 。 如 果 可 以 看 到 明 显 的 产 物 ， 应 该 改 变 循 环 的 参 数 ， 或 重 新 设 计 原 始 引 物 。 利 用 两 个 GSPS 进 行 阳 性 对 照 ： （ 只 有 两 个 GSP 可 以 产 生 重 叠 的 时 候 才 可 以采 用 此 步 。 ） 为 了 确 定 RNA 样 品 中 目 的 基 因 确 实 表 达 ， 利 用 两 个 GSP 和 接 头 连 接的 cDNA 来 产 生 阳 性 对 照 。 可 以 产 生 两 个 引 物 之 间 的 重 叠 大 小 的 片 段 。 如 果 没 有 这
15、 个片 段 ， 应 该 重 复 cDNA 的 合 成 ， 或 者 从 一 个 不 同 的 组 织 或 细 胞 来 源 进 行 cDNA 的 合成 。 制 备 和 抽 提 polyA+RNA 不 要 使 用 DEPC 处 理 过 的 水 。 纯 化 完 mRNA 之 后 ， 利 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 mRNA 的 质 量 。 哺 乳 动 物 的 mRNA 样 品 是 0.5 12kb 的 拖 带 ， 在 其 中 有 4.5 和 1.9kb 的 rRNA 的 条 带 。 非 哺 乳 动 物的 mRNA 应 略 小 具 体 的 实 验 步 骤 cDNA 第 一 条 链 的 合 成
16、： 我 们 建 议 进 行 cDNA 合 成 的 对 照 反 应 ， 这 样 可 以 对 样 品 的 cDNA 的 合 成 进 行 鉴定 。 加 入 各 种 试 剂 之 后 ， 在 气 浴 中 42 度 保 温 一 个 小 时 。 注 意 ： 在 水 浴 或 酒 精 浴 中 保 温 回 减 少 反 应 体 积 ， 从 而 降 低 第 一 链 的 合 成 效 率 。 将 管 放 于 冰 上 ， 以 终 止 第 一 链 的 合 成 反 应 。 直 接 进 行 第 二 链 的 合 成 。 cDNA 第 二 链 的 合 成 ： 第 二 链 合 成 的 酶 混 合 物 中 ， 含 有 聚 合 酶 、 RNaseH 和 连 接 酶 。 T4 DNA 聚 合 酶的 功 能 是 补 平 dscDNA 的 末 端 。 我 们 建 议 做 阳 性 对 照 ， 试 剂 盒 中 提 供 人 类 骨 骼
