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1、1萆薢化浊栓对大鼠前列腺组织中 TNF、IL1及 iNOS 作用的实验研究【摘要】 目的：从免疫学角度，进一步探讨慢性非细菌性前列腺炎可能的病机，以及萆薢化浊栓在其中的可能作用机制。方法：应用大鼠前列腺蛋白提纯液辅以双重免疫佐剂造成实验性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型，以空白栓为空白对照组，前列安栓为阳性对照组，分别检测 TNF、IL1 在前列腺组织中的含量以及 iNOS的表达水平。结果：萆薢化浊栓高剂量组、前列安栓对照组IL1、TNF 含量以及 iNOS 的表达与模型对照组有显著性差异(P0.01)。结论：萆薢化浊栓对免疫性大鼠慢性非细菌性前列腺炎有治疗效果，其效果与剂量相关，其作用可能主要是
2、通过抑制炎症及免疫调节而实现。免疫因素可能是慢性非细菌性前列腺炎重要致病因素之一。 【关键词】 前列腺炎 ;肿瘤坏死因子; 白细胞介素1; 诱导型一氧化氮合成酶;大鼠ABSTRACT Objective: To discuss the possible pathogenesis of abacterial prostatitis and the possible treatment mechanism of BiXieHuaZhuoShuan. Methods: Set up abacterial prostatitis rat model with pure prostatein liqui
3、d 2extrated from rats and double immune adjuvant. Treated control blank group by blank suppository, and positive control group with QianLieAnShuan. Tested TNF, IL1 and iNOS in prostatic tissue. Results: Compared with model control group, high dosage group of BiXieHuaZhuoShuan, control group of QianL
4、ieAnShuan had significant difference in level of TNF, IL1 and iNOS (P0.01). Conclusion: BiXieHuaZhuoShuan has dosedependence effect on chronic abacterial prostatitis. It possibly woks by depressing inflammation and regulating immune system. Immune factors may play an important role in pathopoiesis o
5、f chronic abacterial prostatitis.KEY WORDS Prostatitis; Tumor necrosis factor; Interleukin1; Inducible nitric oxide synthase; Rat慢性非细菌性前列腺炎是中青年男性常见病，其患病率比细菌性前列腺炎高 8 倍,但其病因尚不明确，临床表现复杂多样 1。目前认为最有可能的致病因素是人体全身或局部原因所导致的免疫机能紊乱，对前列腺组织产生程度不等的损伤，其核心问题是炎症形成并持续存在。本试验就是通过检测前列腺组织中 TNF、IL1的含量以及 iNOS 表达，初步探讨其治疗机制，
6、并对免疫性大鼠前3列腺模型进行实验性评价。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 Wistar 种大鼠，雄性，体重 250300 g，由广东医学院实验动物中提供。1.1.2 实验试剂、药品 福氏完全佐剂 (FCA)、卡介苗、白破疫苗、前列安栓(珠海丽珠中药厂，批号：050101)、0.1 M PBS、水合氯醛。1.2 实验方法1.2.1 大鼠前列腺蛋白提纯液的制作 参考周晓辉、韩蕾等2制备大鼠模型方法。步骤：取雄性 Wistar 大鼠 10 只，处死后再剥取前列腺组织，加入含 0.5%TritonX100(内皮细胞损伤剂)的生理盐水溶液，匀浆离心后，取上清液，用 721 分光光度计
7、，以牛血清白蛋白溶液为标准蛋白，采用双缩脲法进行蛋白含量测定，最后用0.1 mol/L PBS 缓冲液稀释为 15 mg/mL 浓度。41.2.2 福氏完全佐剂(FCA) 的制备 将液体石蜡与羊毛脂按21 比例共热至 70 混匀，高温灭菌后按 5 mg/mL 加入佐剂用卡介苗，无菌乳化后使用。1.2.3 动物分组及造模 90 只大鼠随机分成空白对照组(n=15) 、动物模型组(n=75)。动物模型组按以下方法造模：将实验大鼠采用乙醚麻醉，腹腔注射百白破疫苗 0.5 mL，多点皮内注射大鼠前列腺蛋白提纯液和 FCA 乳剂(比例为 11 的混悬液)1 mL。正常对照组分别行腹腔及皮内多点注射 0.
8、9%生理盐水注射液 1 mL。以上各组均分别于 0,20 d、分 2 次注射。待恢复 3 d 后将动物模型组再随机分为：模型对照组(n=15); 萆薢化浊栓高剂量组 (n=15);萆薢化浊栓中剂量组(n=15);萆薢化浊栓低剂量组 (n=15);前列安栓组(n=15)。1.2.4 萆薢化浊栓制作方法 (1)萆薢化浊栓组方以及药量选择。萆薢化浊栓是根据医学心悟3中萆薢分清饮加减变化而来。每剂口服萆薢化浊栓组成：萆薢 10 g、黄柏 10 g、丹参 10 g、茯苓 10 g、赤芍 10 g、白术 10 g。参照中药制剂学4栓剂的载药量一般与口服剂量相当。大鼠和成人用药剂量依据体重折算系数约为 71
9、，正常成年男性体重约为 60 kg，大鼠平均体重按 250 g计算。分别计算出每颗大鼠用萆薢化浊栓的高、中、低剂量组的载生药量分别为 3.5,1.75,0.9 g，比例为 421;每颗成人用前列安栓重 2 g，同理可知大鼠用量 0.06 g。(2)栓剂的制备以及药物含量。5实验药物经鉴定后，根据其有效成分分别进行提取浓缩;将前列安栓融化后备用;甘油、明胶水浴加热致熔化后,将提纯的药物、前列安栓分别均匀分散于基质中;将已配好的药液, 倒入预先已涂过润滑剂的栓剂模具中,分别制作成高、中、低剂量萆薢化浊栓、空白栓和大鼠用前列安栓。萆薢化浊栓高、中、低剂量分别含生药量：3.5 g/颗、1.75 g/颗
10、、0.9 g/颗; 大鼠用前列安栓：0.06 g/颗。1.2.5 给药方法 于造模成功后第 3 天开始给药，刺激大鼠充分排便后以 0.1%水合氯醛腹腔麻醉; 给药剂量除空白组外其余每天1 颗，给药后用软木夹夹闭大鼠肛门，待大鼠苏醒后取下，持续时间约 60 min，连续给药 28 d。给药期间，模型对照组、前列安栓组有 1 只大鼠死亡，草蔛化浊栓高剂量组有 2 只大鼠死亡，经检查，未见异常。1.2.6 前列腺组织取材和指标检测 给药 28 d 后，取出前列腺组织，右侧叶固定后石蜡切片，检测 iNOS 的表达; 左侧叶 ELISA法检测 TNF、IL1 。iNOS 表达的结果判定(采用双盲法阅片)
11、:iNOS 以胞浆出现棕黄色颗粒作为阳性标准; 结合染色强度和阳性细胞数分级，每一切片随机用显微镜选取 3 个视野 (100)，在高倍镜(400)选取 100 个细胞，计算阳性细胞所占百分数。51%为 3 分。按着色程度计分：基本未着色、染色与背景相似者为 0 分;着色浅、6略高于背景者为 1 分;中度着色、明显高于背景者为 2 分;强染、着色深棕者为 3 分。两项合并 01 分为阴性(-)，2 分为阳性(+) ，3 分为强阳性(+)。1.3 统计学处理实验数据采用 SPSS11.0 统计软件行统计学分析，计量资料用(s)表示，各组间比较采用单因素方差分析。分类资料用“率”表示，采用 2 检验
12、。差异无统计学意义 (P0.05);差异有统计学意义(P0.05);差异有高度统计学意义(P0.01)。2 结果2.1 IL1 和 TNF 在各组大鼠前列腺组织中的含量变化(s)结果表明：(1)慢性非细菌性前列腺炎的发生发展过程中，前列腺组织中 IL1 和 TNF 含量明显高于正常 ;(2)萆薢化浊栓高、中剂量组和前列安栓组均可明显降低 IL1 和 TNF 含量，但以萆薢化浊栓高剂量组降低程度最明显，其次为前列安栓组;(3)萆薢化浊栓低剂量组对降低 IL1 含量的作用不明显;(4) 萆薢化浊栓低剂量组能够降低 TNF 含量，作用较前列安栓差。见表 1。72.2 iNOS 在大鼠前列腺组织中的表
13、达情况结果表明：(1)慢性非细菌性前列腺炎发生、发展过程中，在前列腺组织中存在 iNOS 过度表达;(2) 萆薢化浊栓高剂量组、前列安栓组均能明显抑制 iNOS 表达;(3) 萆薢化浊栓中、低剂量组能够抑制iNOS 表达，但作用效果不及萆薢化浊栓高剂量组和前列安栓组。见表 2。表 1 IL1、TNF 在各组中的含量注：与空白对照组比较，*P0.01; 与模型对照组比较，P0.05, P0.01;与前列安栓组表 2 iNOS 的表达情况注：与空白对照组比较：*P0.05 *P0.01;与模型对照组比较：P0.05 P0.01;与前列安栓组比较： P0.05。3 讨论造成慢性非细菌性前列腺炎的病因
14、至今仍未明确，目前认为最有可能导致疾病的病因是人体全身或局部原因所导致的免疫机能紊乱，使前列腺组织免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面都发生改变，这种变化超出了机体可以调控的范围，就会对前列腺组织产生程度不等的损伤，其核心问题是炎症形成并持续存在。在慢性非细菌性前列腺炎中，自始至终都伴有细胞因子的异常表达。顽固的细胞活化和伴随而至的组织损伤形成恶性循环，是慢性炎症中最难解决的问题。而细胞因子与炎症细胞的渗出激活，炎症病理8性损伤，成纤维细胞的增殖等密切相关，直接或间接影响炎症的发生、发展及预后。我们可以将慢性非细菌性前列腺炎的免疫学发病机制初步归纳如下：当机体罹患某些疾病或机体内外环境发生
15、了某些特定的变化，可以导致前列腺局部抗原(PSA) 的暴露，进而刺激血液、组织中的 CD4T 淋巴细胞,直接或间接造成免疫活性细胞浸润前列腺组织。细胞因子(如 IL1 和 TNF)又使 iNOS 和细胞粘附分子强烈表达。iNOS 通过产生大量的一氧化氮导致组织损伤。NO 又与过氧化物反应生成过二硫酸盐，促进细胞毒素反应和 DNA 损伤。因此说TNF、IL1 、iNOS 这些炎性基因的表达产物，在机体的免疫调节以及慢性非细菌性前列腺炎的发病过程中起着非常重要的作用。通过实验我们发现，萆薢化浊栓能够调节免疫，其作用是通过抑制 IL1、TNF 等细胞因子的产生和分泌，从而抑制免疫反应，减轻炎症损伤。萆薢化浊栓还能够降低 iNOS 在前列腺局部的表达，避免局部产生过量的 NO，减轻局部炎性损伤，从而达到治疗目的。【参考文献】1 裘法祖. 外科学M.第 4 版.北京：人民卫生出版社，91996.640-641.2 周晓辉，韩蕾，周智恒,等. 免疫性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的形态学与分子生物学特性J.中华男科学杂志,2005 ，11(4)：290-295.3 清 .程国彭.医学心悟M.北京：人民卫生出版社,1963.130.4 郑品清.中药制剂学M.北京：中国医药科技出版社,1998.377.
