孕 早 期 绒 毛 细 胞 原 位 杂 交 监 测 人 巨 细 胞 病 毒宫 内 感 染 的 价 值冯 玲 闻 良 珍华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附 属 同 济 医 院 妇 产 科 , 武 汉 430030摘 要 用 地 高 辛 标 记 人 巨 细 胞 病 毒 (HCMV ) DNA 探 针 , 对 105 例 孕 早 期 妇 女 (其 中 有 异 常 妊 娠 史 者 45 例 ) 绒 毛细 胞 进 行 原 位 杂 交 ( ISH ) 结 果 发 现 : 正 常 组 与 异 常 妊 娠 史 组 ISH 阳 性 率 分 别 为 25100% 及 48189% , P < 0105 与 PCR法 相 比 , 该 方 法 敏 感 度 55100% , 特 异 度 76192% , 符 合 率 68157% , 且 可 进 行 病 毒 核 酸 定 位 及 半 定 量 提 示 : 用 地 高辛 标 记 探 针 进 行 绒 毛 细 胞 原 位 杂 交 , 监 测 HCMV 宫 内 感 染 是 可 行 的 , 为 进 一 步 探 讨 HCMV 感 染 引 起 不 良 妊 娠 的 机 理 提供 了 一 条 新 途 径 , 并 为 胎 儿 取 舍 提 供 更 确 切 的 科 学 依 据 , 减 少 低 质 儿 的 出 生 。
关 键 词 人 巨 细 胞 病 毒 ; 原 位 杂 交 ; 宫 内 感 染中 图 法 分 类 号 R 37319Evaluation of Early Pregnancy Chor ion Cells w ith in SituHybr idization to D etect HCM V In trauter ine InfectionFeng L ing, W en L iangzhenD ep artm ent of O bstetrics and Gy necolog y , T ong j i H osp ital, T ong j iM ed ical Colleg e,H uazhong U niversity of S cience and T echnolog y , W uhan 430030Abstract T he HCM V DNA p robe labeled w ith digoxin w as used for 105 wom en w ith early p regnancy( including 45 casesw ith a h istory of abnorm al p regnancy) to m ake in situ hybridization ( ISH ) of chorion cells.It w as found that the ISH positive rate in norm al group and abnorm al group w as 25100 % and 8189 % respec2tively (P < 0105). A s compared w ith the results of PCR , ISH had a sensitivity of 55100 % and a specificity of76192 % , and the suitability w as 68157 %. ISH could be used to localize and sem i2quantitate the virus DNA.It w as p racticable to detect HCM V intrauterine infection by chorion cells ISH w ith digoxin2labeled p robe.Key words hum an cytom egalovirus; in situ hybridization; intrauterine infection冯 玲 , 女 , 1963 年 生 , 副 教 授 , 副 主 任 医 师人 巨 细 胞 病 毒 ( hum an cytom egalovirus,HCM V ) 在 人 群 中 感 染 极 为 普 遍 。
我 国 报 道 孕 妇HCM V 感 染 率 为 80%～ 97% [1～ 4 ] 孕 早 期 HCM V感 染 是 引 起 宫 内 感 染 和 胎 儿 发 育 异 常 的 重 要 原因 [5 ] 原 位 杂 交 ( In situ hybridization, ISH ) 方 法 检测 受 染 组 织 的 病 毒 核 酸 , 是 当 前 分 子 病 理 学 研 究 采用 的 先 进 技 术 之 一 本 实 验 应 用 ISH 技 术 对 早 孕 绒毛 进 行 HCM V 感 染 的 监 测 , 旨 在 为 早 期 快 速 准 确的 产 前 诊 断 HCM V 感 染 及 进 一 步 探 讨 HCM V 致病 机 理 提 供 一 条 有 益 的 新 途 径 1 材 料 与 方 法111 检 测 对 象随 机 选 择 1998 年 1 月 ～ 8 月 及 1999 年 1 月 ～2000 年 12 月 在 我 院 行 人 工 流 产 的 健 康 孕 妇 78 例及 血 清 HCM V IgM 阳 性 和 (或 ) HCM V DNA 阳 性行 产 前 诊 断 者 27 例 , 其 中 有 异 常 妊 娠 史 者 (包 括 流产 、 死 胎 、 死 产 或 曾 生 育 畸 形 儿 ) 45 例 , 4 例 本 次妊 娠 自 然 流 产 。
年 龄 21～ 35 岁 , 孕 龄 39～ 84 d112 检 测 方 法11211 标 本 采 集 : 在 严 格 消 毒 条 件 下 , 经 宫 颈 (产前 宫 内 诊 断 者 在 B 超 监 测 下 ) 抽 取 绒 毛 组 织 量 约 25～ 30 m g, 用 生 理 盐 水 洗 净 残 余 血 , 分 成 2 份 , 一 份- 20℃ 冻 存 待 测 ; 一 份 直 接 制 备 染 色 体 及 绒 毛 细 胞涂 片 , 同 时 抽 取 孕 妇 外 周 血 115 m l, 置 于 无 菌 盛 有适 量 肝 素 的 212 m l Eppendorf 管 中 , 低 温 冻 存 待 测 11212 血 清 HCM V IgM、 IgG 抗 体 测 定 : 采 用EL ISA 法 , 试 剂 盒 由 美 国 Hope 公 司 提 供 , 操 作 严 格按 说 明 书 进 行 , 其 中 抗 HCM V IgM 具 有 排 除 类 风湿 因 子 干 扰 系 统 11213 HCM V DNA 测 定 : 应 用 PCR 进 行 检 测 11214 对 绒 毛 细 胞 直 接 制 备 染 色 体 : 采 用 本 研 究 室第 31 卷 第 6 期 第 672 页2002 年 12 月华 中 科 技 大 学 学 报 (医 学 版 )J Huazhong U niv Sci Tech [Health Sci]Vol. 31 No. 6 P. 672Dec. 2002创 立 的 方 法 。
11215 绒 毛 细 胞 原 位 杂 交 : 采 用 地 高 辛 标 记 探 针 ,对 未 经 培 养 的 绒 毛 间 质 细 胞 进 行 原 位 杂 交 试 剂 来源 : 探 针 标 记 及 检 测 试 剂 盒 由 德 国 Boeh ringerM annheim 公 司 提 供 操 作 方 法 : ① 探 针 的 制 备 :HCM V 2DNA 探 针 购 自 北 京 医 科 大 学 病 理 室 ② 探针 的 标 记 : 按 试 剂 盒 说 明 ③ 绒 毛 细 胞 制 片 : 挑 选绒 毛 5～ 10 m g, 生 理 盐 水 或 R PM I 1640 漂 洗 后 , 加1 m l固 定 液 甲 醇 ∶ 冰 乙 酸 (3∶ 1) 离 心 去 上 清 , 再固 定 2 次 , 每 次 20 m in, 继 之 反 固 定 甲 醇 ∶ 冰 乙 酸(1∶ 2) 30 m in, 去 除 绒 毛 枝 , 细 胞 悬 液 涂 片 (玻 片已 硅 化 处 理 ) , 置 - 20℃ 待 检 ④ 原 位 杂 交 流 程 : 玻片 自 - 20℃ 取 出 , 012 mol L HC l室 温 30 m in, 双 蒸水 漂 洗 2～ 3 次 × 3 m in, 0101 mol L PBS 浸 泡 2 次× 3 m in; 蛋 白 酶 K 消 化 15～ 30 m in, 37 ℃ , 然 后用 2 g L 甘 氨 酸 中 止 反 应 , 2 次 × 3 m in, 继 用 双 蒸水 漂 洗 2 次 × 3 m in。
预 杂 交 : 杂 交 液 即 5× SSC; 5g L B lock ing reagent (w v) ; 1 g L N 2lauroylsar2cosine (w v) ; 012 L SD S (w v) , 20 Ll 片 , 42℃ ,30 m in; 杂 交 : 探 针 浓 度 1 ng m l, 每 片 30～ 50 Ll,94℃ , 10 m in (湿 环 境 ) , 骤 冷 , 盖 玻 片 (已 硅 化 ) ,石 蜡 封 片 , 42℃ 16 h; 去 盖 玻 片 , 用 含 1 g L SD S的 2× SSC 漂 洗 2 次 × 5 m in, 含 1 g L SD S 的 011× SSC 漂 洗 1 次 × 5 m in, Buffer I (011 mol L T ris2C l pH 715 及 0115 mol L N aC l) 漂 洗 4 次 × 3 m in;Buffer ˚ [ 5 g L B lock ing reagent, Buffer (w v) ] 封 闭 37℃ , 30 m in; 加 抗 D igoxin 抗 体 (A nti2digoxigenin2A P∶ Buffer˚ 1∶ 2500～ 5000, 即 用 即配 ) 37℃ , 1～ 2 h; 用 Buffer 漂 洗 4 次 × 3m in 后用 Buffer ¸ (011 mol L T ris2C l; 011 mol L N aC l;015 mol L M gC l2) 平 衡 2 次 × 2 m in, 用 NBT BC IP避 光 显 色 1 h 或 过 夜 。
用 Buffer 冲 洗 未 结 合 的 显色 剂 , 中 性 树 胶 封 片 ⑤ 结 果 判 断 : 光 学 显 微 镜 下 观察 , 蓝 紫 色 颗 粒 者 为 阳 性 113 统 计 学 方 法部 分 数 据 采 用 校 正 V2检 验 2 结 果211 母 血 清 HCM V 抗 体 检 测 结 果105 例 孕 早 期 妇 女 , IgM 阳 性 、 IgG 阴 性 者 37例 , 总 阳 性 率 35124% , 其 中 正 常 孕 妇 60 例 , IgM阳 性 4 例 , 阳 性 率 6167% , 异 常 妊 娠 史 45 例 , IgM阳 性 33 例 , 阳 性 率 73133% , 两 组 比 较 P < 0101;IgM 阴 性 、 IgG 阳 性 者 41 例 , 阳 性 率 52156% ; IgM、IgG 均 阴 性 27 例 ; 无 IgM、 IgG 均 阳 性 者 212 绒 毛 组 织 HCM V D NA 检 测 结 果105 份 绒 毛 HCM V DNA 阳 性 40 例 , 其 中 10例 母 血 HCM V IgM (+ ) , 30 例 母 血 (- )。
213 绒 毛 染 色 体 检 查 结 果105 份 。