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1、1脆性 X 智力低下蛋白结构及功能的研究进展【关键词】 脆性 X 综合征；基因；RNA 结合蛋白质类；树突脆性 X 综合征（fragile X syndrome,FXS）是一种发病率仅次于唐氏综合征的遗传性智力低下疾病，其发病率在男性为 1/4 000，女性为 1/8 000。临床主要表现为：程度不等的智力低下、巨睾丸、特殊面容、语言发育障碍以及行为异常（如注意力集中时间短、拍手、目光接触回避）等。脆性 X 智力低下 1 基因（fragile X mental retardation 1 gene,FMR1）位于染色体 Xq27.3,由 17个外显子和 16 个内含子组成，横跨 38 kb。其
2、 5末端非编码区有一 CGG 三核苷酸重复序列，在其上游 250 bp 左右有一 CpG 岛，其甲基化可导致脆性 X 综合征。根据 CGG 三核苷酸重复数，可以把 FMR1 基因分为四种类型：正常型（normal type,n50） ，中间型（intermediate type,50 1 脆性 X 智力低下蛋白的结构FMR1 基因编码的脆性 X 智力低下蛋白（fragile X mental retardion protein，FMRP）蛋白主要位于细胞质，少量见于细胞核，分布于哺乳动物的脑、睾丸、脾、血液、肝等组织，由 632 个氨基酸残基组成，分子量约为 6970 kDa。其氨基酸序列可以
3、分为三个部分：N 末端（1 204） ，2 个 KH 结构域（205422） ，C2末端（516632 ） （图 1）,其中 N 末端（Nterminal domain of FMRP,NDF）是一高度保守的氨基酸序列，而高度可变的 C 末端则含有一 RGG 框（精氨酸甘氨酸簇） ，2 个 KH 结构域（核蛋白 K 同源结构域）即 KH1 与 KH2 结构域分别由外显子 7 和外显子 8、9编码，而 RGG 框则由外显子 15、16 编码。FMRP 还有一个核定位信号（NLS ）和一个核输出信号（NES） ，分别位于 FMRP 的第115150 氨基酸残基内和 FMR1 基因第 14 外显子编
4、码的氨基酸序列内。FMRP 含有四个 RNA 结合区域，分别为 KH1 结构域，KH2结构域，RGG 框以及位于 NDF 的 RNA 结合区域。1.1 KH 结构域KH 结构域首次发现于人不均一核酸核糖核蛋白 K（human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K） ，由大约 70 个氨基酸残基组成，广泛存在于原核和真核生物的多种蛋白中，一般以多拷贝的形式存在，如在 FMRP 中存在两个 KH 结构域，hnRNP K 中有三个 KH 结构域。KH 结构域因其二级结构的三维空间折叠方式不同可以分为型和型，型是 1122 方式，型则是 1
5、122 方式，所有典型的 KH 结构域都有一 GXXG 环 1 。KH 结构域可以与 RNA 相结合并调节转录与翻译以及细胞的发育。FMRP 蛋白的 KH2 结构域能与序列特异性的RNA 复合物结合，此复合物被称为环 环假结体（looploop 3pseudoknot） ，或是 kissing 复合体(kissing complex)，而位于KH2 结构域内的 Ile304Asn 突变可导致其不能与 kissing 复合体结合，表明完整的 KH 结构域是 FMRP 与靶 RNA 结合所必需的2 。1.2 RGG 框RGG 框是由 ArgGlyGly 重复片段组成的 RNA 结合区域，首次发现于
6、人不均一核酸核糖核蛋白 U(hnRNP U)的 C 末端。FMRP 蛋白 C 末端 RGG 框能与富含鸟嘌呤的 RNA 结合，此 RNA具有 Gquadruplex 结构（鸟嘌呤四联体） ，RGG 框通过特异性识别 Gquadruplex 结构而结合 RNA。FMRP RGG 框可与 Sc1 RNA通过疏水键和氢键以及静电作用力相互结合，而这种结合可以增加RNA Gquadruplex 结构的稳定性，FMRP RGG 框能与靶 RNA结合除了靶 RNA 具备 Gquadruplex 结构外，还必须具有径环或是 stemG quartet 连接部位3 。但 Bole 等随后的研究表明具有 Gqu
7、adruplex 结构的 RNA 就足以结合 FMRP RGG 框，径环结构可能具有校正 FMRP RGG 框与靶 RNA 正确结合的功能4 。1.3 NDFFMRP 蛋白的 NDF 由 134 个氨基酸残基组成，具有热稳定4性和 结构，可形成稳定的二聚体。 NDF 与已知的任何 RNA 结合区域都没有同源性，但与“Royal 家族”中的 Tudor 蛋白具有高度同源性5 。研究显示， FMRP 的 NDF 是由一短的 螺旋连接两个重复的 Tudor 结构域组成，其中第二个 Tudor 结构域能与甲基化的赖氨酸及一种 82 kD 大小的 FMRP 结合蛋白(82kD FMRP interact
8、ing protein，82FIP) 相互作用，且 NDF 还含有一 3D 的核定位信号,故 NDF 折叠结构的不稳定性可改变 FMRP 在细胞核的定位6 。2 FMRP 的功能2.1 FMRP 与靶 RNAFMRP 是一种选择性 RNA 结合蛋白，通过其功能域可以选择性地与包括自身 mRNA 和与神经发育、树突可塑性有关的大约 4%的脑组织 mRNA 相结合 ,对转录，RNA 转运，mRNA 的稳定性均有作用，因此鉴别其靶 RNA 是了解 FMRP 功能及 FXS 发病机制的关键。Darnell 等总结了一系列用于鉴定 FMRP 靶 RNA 的方法包括免疫共沉淀、微测量、抗体定位的 RNA
9、扩增（antibodypositioned RNA amplication，APRA ） 、阴性 RNA 选择策略、交联免疫沉淀等7 。运用酵母三杂交系统和人类胚胎海马 cDNA 文库，Zou 等鉴别了 22 种靶 mRNA,18 种已确证与 FMRP 有关，而其中有些5mRNA 可编码结构蛋白，关键酶或是涉及细胞发育全过程的蛋白质，尤其是与神经系统发育和功能有关的蛋白质8 。FMRP 还控制着靶 RNA 运输与翻译，已阐明 FMRP 是一种翻译调控因子，但是关于 FMRP 调节 mRNA 在神经系统的运输和定位作用尚未明确，运用果蝇 mRNA 成像系统， Estes 首次阐明 FMRP 可控
10、制 mRNA 的运输，研究表明 mRNA 颗粒在 FMR1 突变的果蝇神经中其能动性和方向性减弱，而在光漂白实验后再进行荧光修复实验中发现mRNA 分子的能动性与 FMRP 的含量有关9 。FMRP 作为信使核蛋白微粒（mRNP）的组成成分影响着脑组织中 mRNA 稳定性，已鉴定两种 mRNA 即 Nxf1 mRNA 和 PSD95 mRNA 的稳定性与FMRP 有关，其中 Nxf1 mRNA 编码 mRNP 出核受体大亚单位，而 PSD95 mRNA 编码鹰架蛋白，FMRP 可抑制 PSD95 mRNA降解或加速 Nxf1 mRNA 的降解，因此对涉及 mRNA 稳定性的FMRPmRNP 的
11、进一步研究有助于开拓一条新的途径来研究FMRP 的功能及其对 FXS 的作用10 。2.2 FMRP 是一种翻译调控因子研究已表明，FMRP 能与核糖体及 mRNP 结合形成复合物,影响突触后及树突的具有翻译活性的多聚核糖体的功能而抑制神经细胞的基因表达。Laggerbauer 等在体外利用兔网织红细胞和非洲蟾蜍卵细胞研究 FMRP,发现 FMRP 可以与多种 mRNA 结合（二氢6叶酸还原酶 mRNA，荧光素酶 mRNA，SMN mRNA，FMR1 mRNA）而抑制 mRNA 翻译，而突变型 I304N 由于不能形成同源低聚物而不能发挥抑制翻译的功能11 。 Li 等同样运用兔网织红细胞裂解
12、系统（RRL ）研究 FMRP 在调节翻译方面的作用时发现，FMRP 重组体可以引起剂量依赖性的脑组织多聚腺嘌呤尾 RNA 翻译抑制但不会导致 mRNA 降解，而若除去翻译模板上的 FMRP 结合位点则 FMRP 不能发挥抑制翻译的作用，表明 FMRP 与 mRNA结合是抑制翻译的关键，从而可推断 FMRP 可能是一种翻译抑制因子12 。但是有研究表明，FMRP 也可正向调节蛋白的合成：运用各种生物化学技术检测敲除了 FMR1 基因的小鼠脑组织微管相关蛋白 MAP1B 和 MAP1B mRNA 的表达水平，与野生型的相比表达大大降低13 。研究还发现，FMRP 通过一新发现的 RNA 结合域S
13、oSLIP(Sod1 mRNA Stem Loop interacting with FMRP)结合过氧化物歧化酶 1（Superoxide Dismutase 1）mRNA,SoSLIP 具有三叶草结构，FMRP 与之结合后可诱导其结构改变而激活翻译，而缺乏 FMRP 则 Sod1 的表达减少14 。由此可以推断 FMRP 可以双向调节蛋白的合成，从而发挥其相应的功能。2.3 FMRP 与树突的可塑性大脑海马和颞叶联合皮层对人的记忆有着非常重要的意义，而 FMRP 在海马和颞叶联合皮层表达最强， FXS 患者因缺乏 FMRP7而表现为智力低下，提示 FMRP 对学习和记忆有一定作用。长时程增
14、强和长时程抑制是近几年来研究树突可塑性的两大模块，在敲除了 FMRP 小鼠的新皮质其长时程增强效应与野生型的相比大大减弱，而此效应的减弱与新皮质的代谢性谷氨酸受体 5（metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5) 的调节活性有关，若增强mGluR5 的调节活性则可增强敲除了 FMRP 小鼠树突的长时程抑制效应，可以推断 FMRP 缺乏可改变树突的可塑性 15 。大量定位于额皮质、海马 CA3 区及嗅球的 FMRP 经免疫电子显微术观察表明，FMRP 表达于突触前末端及轴突内富含实体颗粒的（ fragile X granules, FXG）区域内，实验发现
15、FXG 表达高峰主要是在神经形成后 24 周，而此期正是突触形成及成熟时期，可以推测 FMRP可能在哺乳动物中枢神经系统的实体颗粒发育过程中起着重要的作用16 。FMRP 还与突触的成熟、稳定、及衰老有关。运用电生理学技术和免疫组织化学技术，Pfeiffer 等研究了在缺乏 FMR1 基因的神经元细胞内体外表达 FMRP 对突触的功能和成熟状态的影响，研究发现，在缺乏 FMR1 基因的神经元细胞内急性表达突触后FMRP 可减少具有功能和结构的突触联接的数量，但不改变突触的成熟状态17 。还有研究发现，敲除了 FMR1 基因的小鼠体内，其较长，较薄的树突棘的数量增加而短而粗的树突棘则减少18 。
16、总结大量的实验研究表明，FMRP 缺乏是引起突触的可塑性及结构重塑异常，导致智力低下，记忆，学习能力受损的重要因素。福建医科大学学报 2010 年 8 月 第 44 卷第 4 期廖 娟等：脆性 X 智力8低下蛋白结构及功能的研究进展3 与 FMRP 相互作用的蛋白质3.1 脆性 X 相关蛋白 1 与脆性 X 相关蛋白 2位于常染色体(3q28 和 17q13.1)与 FMR1 基因非常相似的基因: 脆性 X 相关基因 1（fragile X relative gene 1,FXR1）和脆性X 相关基因 2（fragile X relative gene 2,FXR2）, 两者分别编码脆性 X 相关蛋白 1（fragile X relative protein 1,FXR1P）和脆性 X相关蛋白 2（fragile X relat
