《细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4 基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究作者：李恒, 傅振坤, 王丽虹, 李大林, 吴娜 , 章婕, 李殿俊【摘要 】 目的 : 探讨 CTLA4 基因多态性位点1722T/C 和CT60G/A 与中国北方汉族妇女乳腺癌易感性的关系。方法 : 采用聚合酶链反应（PCR）和限制性片段长度多态性方法, 对 328 例中国北方汉族乳腺癌患者和 327 例正常对照者进行 CTLA4 基因1722位点和 CT60 位点多态性检测。 结果: 乳腺癌患者 CTLA4 基因CT60 位点 G 等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组（28.7% 比 23.5%; P=0.0
2、352, OR=1.30, 95% CI=1.021.67）; 1722CCT60A 单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有明显差异（P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.970.61）, 而在1722 位点基因型频率、 等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论: CTLA4 基因多态性1722 和 CT60 两个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性。 【关键词】 乳腺癌 CTLA 4 基因 单核苷酸多态性 单体型Abstract AIM: To investigate the association between the CTLA4
3、 promoter1722(T/C) and 3 untranslated region 2CT60(G/A) polymorphisms and the risk of breast cancer in Han women of northeast China. METHODS: 328 patients with breast cancer and 327 healthy people as control were genotyped for 1722 and CT60 polymorphism using polymerase chain reaction and restrictio
4、n fragment length polymorphism. RESULTS: The frequency of the G allele at the CT60 site in breast cancer patients was statistically higher than that in control（28.7% vs 23.5%, P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02-1.67）. The frequency of 1722CCT60A haplotype in control was significantly higher than that in
5、 breast cancer patients（P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97-0.61）. However, the distribution of genotypes at 1722 site was not significantly different between breast cancer patients and control. CONCLUSION: The polymorphism of 1722T/C and CT60G/A may be related to the development of breast cancer in Han
6、women of northern China.Keywordsbreast cancer; CTLA4 gene; single nucleotide polymorphism; haplotype乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤, 其发病机制虽然尚未完全清楚, 但是免疫系统在其中的作用已逐渐引起了人们的关注。3有研究表明, 乳腺癌患者体内存在免疫系统的抑制性环境, 特别是在年轻患者和病情严重患者更为明显, 其中 T 细胞表面的细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（CTLA4 ）分子发挥了重要作用1。人类CTLA4 基因定位于 2 号染色体长臂 33 带（ 2q33）, 主要表达在活化的 T
7、细胞上, 它可与抗原提呈细胞表面的 B7 分子结合并抑制 T细胞的增殖与活化2。有研究表明位于 CTLA4 基因 3端非编码区和基因启动子区的基因变异影响了 CTLA4 的表达和转录, 其中单核苷酸多态性位点 CT60 显示出了较强的关联性, 但并不能排除其他位点的作用3。为了进一步验证上述基因遗传多态性是否与我国北方汉族妇女乳腺癌的发生相关, 我们选择了转录本末端 CT60G/A 位点和基因启动子区的1722T/C 位点进行了此次病例的对照研究。1 材料和方法1.1 对象及材料 乳腺癌病例为在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院进行手术治疗的患者, 共 340 例, 均经组织病理学确诊, 术前均未行放
8、射或化学治疗, 年龄 3073 岁, 经患者本人及家属同意的情况下, 取空腹外周静脉血。正常对照组人群外周血由哈尔滨医科大学附属第一医院提供的体检女性获得, 共 350 例, 平均年龄为(46.317.0)岁, 要求没有癌症家族史, 其他详细记录与乳腺癌患者相同。DNA 提取试剂盒购自天为时代公司; 温度梯度 DNA 扩增仪购自 Biometra 公司; Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司; 引物由4上海生物工程公司测序。1.2 方法1.2.1 基因组 DNA 提取 抽取肿瘤患者及正常对照个体的外周血 5 mL, 以 ACD 抗凝, 使用 DNA 提取试剂盒从外周静脉血标本抽提基因
9、组 DNA, -20 保存。1.2.2 CTLA4 的1722 、 CT60 基因片段扩增 采用 PCR方法, 用温度梯度 DNA 扩增仪从基因组 DNA 中扩增 CTLA4 基因中含有相应位点的基因片段。PCR 反应体系为 25 L, 其中基因组DNA 0.3 g, 1PCR 缓冲液, 0.3 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, 2 U Taq DNA 聚合酶, 上、 下游引物各 0.1 mol/L。PCR 反应条件为: （1 ）启动子区 1722T/C 位点 PCR 引物序列: 上游为 5CTAAGAGCATCCGCTTGCACCT3; 下游为5TTGGTGTG
10、ATGCACAGAAGCCTTT3。PCR 扩增条件: 94预变性 5 min; 94 15 s, 58 5 s, 72 45 s 进行 30 个循环; 最后 72延伸 7min。 PCR 扩增片段为 486bp。 （2）转录本末端CT60G/A 位点 PCR 引物序列: 上游为5GAGGTGAAGAACCTGTGTGTTAAA3; 下游为5ATAATGCTTCATGAGTCAGCTT3。 PCR 扩增条件: 94 预变性 5 min; 94 30 s, 55.6 30 s, 72 30 s 进行 30 个循环; 最后572延伸 5 min。PCR 扩增片段为 178 bp。1.2.3 限制性
11、片段长度多态性分析 PCR 扩增产物分别加入限制性内切酶 Bbv 和 HpyCH , 于 37水浴 16h, 20g/L 琼脂糖凝胶电泳分离, 然后用溴化乙啶染色观察。1.2.4 统计学处理 采用 Arlequin 软件进行HardyWeinberg 平衡规律计算基因型和等位基因频率, 运用统计学软件 SPSS 和 haploview 协助对单体型数据进行处理 , 采用 2 检验和 Logistic 回归分析计算比数比（ odds ratio, OR）及其 95%可信区间（confidence interval, CI）, 以 P0.05）, 但是 G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对
12、照组（28.7% 比23.5%; P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.021.67） 。然而, 在1722 位点上 , 乳腺癌患者组 T/T、 T/C、 C/C 基因型频率以及T、 C 等位基因频率与正常对照组比较差别均无统计学意义。图 1 CTLA4 基因含1722T/C 位点的 PCR 产物经 Bbv酶切后的电泳图（略）Fig 1 Electrophoresis chart of PCR products containing 1722T/C SNP of CTLA4 digested by Bbv M: DNA marker; 1: TT; 2, 4: CC; 3:
13、TC.图 2 CTLA4 基因含 CT60G/A 位点的 PCR 产物经 HpyCH 7酶切后的电泳图（略）Fig 2 Electrophoresis chart of PCR products containing CT60G/A SNP of CTLA4 digested by HpyCH M: DNA marker; 1, 3, 5: AA; 2, 4: AG; 6: GG.表 1 乳腺癌患者和正常对照1722T/C 、 CT60G/A 位点基因型及等位基因分布（略）Tab 1 Distributions of genotypes and alleles in 1722 T/C and
14、CT60G/A of patients and controls2.3 乳腺癌患者和正常对照组 CTLA4 单体型分析 CTLA4 单体型与乳腺癌相关性的分析应用 haploview 软件, 1722 和 CT602 个位点构成了 3 个主要的单体型（频率5%） 。其中1722CCT60A 单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有统计学意义（P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.970.61）; 而1722TCT60A 和1722TCT60G2 个单体型在病例组和对照组中的频率无统计学意义(表 2)。表 2 乳腺癌患者和正常对照1722T/C 、 CT60G/A 位点单8体型分析（略）Tab 2 Analysis of haplotype frequencies between alleles of 172
