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1、1细胞因子表达谱在人脐带 Wharton 胶间质干细胞诱导分化成软骨细胞的变化作者：侯克东郭全义张莉袁玫眭翔汪爱媛许文静刘舒云卢世璧【摘要 】 目的观察从人脐带 Whartons 胶中分离的间质干细胞(WMSC)诱导分化成软骨细胞时表达细胞因子及生长因子的异同，从而为 WMSC 诱导的软骨细胞用于组织工程的构建以及其在临床的应用打下基础。 方法从人正常足月分娩的脐带中分离间质干细胞，在体外以条件培基诱导分化成软骨细胞，免疫组化法鉴定其特性，应用细胞因子蛋白芯片方法检测 WMSC 及其诱导分化的软骨细胞所表达细胞因子及生长因子，并取成年人正常关节软骨为对照。 结果78 种细胞因子和生长因子在 W
2、MSC 及其诱导分化的软骨细胞均有表达，两者表达谱相同，而表达量则多少有不同。诱导分化后表达量增多的因子为：MIP-3，ENA-78，VEGF，PDGF-BB，SCF ，FGF-7，GCP-2 及 SDF-1。减少的因子为 MIP-1HGF，NT-4，IL-10 及 MIP-。其共同表达的具免疫抑制作用的因子对降低异体移植时的免疫排斥可能有一定作用，其共同表达的金属蛋白酶抑制因子对其移植于体内时可具有保护作用。而共同表达的肿瘤生长抑制因子则可减少对干细胞移植后瘤变的担心。 结论从人脐带 whartons 胶中分离的间质干细胞2(WMSC)诱导分化成软骨细胞时表达细胞因子及生长因子谱相同，是一种
3、理想的可替代自身软骨细胞的新型种子细胞，用于构建工程软骨组织。 【关键词】 干细胞软骨细胞细胞因子生长因子蛋白芯片法Abstract: ObjectiveTo study cytokine and growth factor expression patterns of chondrocytes differentiated from mesenchymal cells isolated from human umbilical cord Whartons jelly and of normal adult articular chondrocytes. MethodsFresh umbili
4、cal cord were collected from healthy donor full-term births.Mesenchymal stem cells were isolated from Whartons jelly of two human unbilical cords and cultured in conditional medium to differentiate to cartilage cells. Immunochemical staining method was used to identify the cartilage cell phenotype.
5、Normal adult articular cartilage cells were isolated from one donor. Cytokine antibody-array technology (Clontech) was used to analyze cytokines and growth factors.Results The cytokine and growth factor profiles of chondrocytes differentiated from WMSC(Wharton jelly MSC) and normal cartilage cells w
6、ere similar, but the 3expression level was somewhat different. The maximum expression in chondrocyte were:MIP-3, ENA-78, VEGF, PDGF-BB, SCF, FGF-7, GCP-2 and SDF-1. The decreased factors were :MIP-I,HGF, NT-4, IL-10 and MIP-.A range of soluble immune tolerant factors IL-10, TGF, VEGF and HGF were ex
7、pressed in significant amount, thus creating a local immunosuppressive environment. This result suggests that those factors may contribute to the ability of WMSC to avoid allorejection. WMSC and derived cartilage cell can produce oncostatin M and LIGHT, and high level of TIMP-1 and TIMP-2, which may
8、 help for prevent malignant change and enzyme digestion in vivo during transplantation.Conclusion These findings should encourage the use of mesenchymal stem cells from Whartons jelly of human umbilical cord as a potential new seed cells in cartilage tissue engineering.Key words：stem cells；chondrocy
9、te ； cytokines；growth factors；protein antibody array干细胞应用于再生医学已从研究进入了临床应用，应用的主要是骨髓干细胞。干细胞应用于关节软骨的修复重建，除自体关节4软骨细胞外，也主要是从骨髓中分离间质干细胞1、2 ，并有初步的临床应用报告，然而，异体骨髓干细胞的来源有限，且免疫配型不完全符合将导致免疫排斥和治疗失败，自体骨髓中干细胞随着年龄的增长而减少，且取材时有轻度创伤，为克服这些缺点，寻找更理想的新的干细胞来源是所需要的。从人脐带 Whartons 胶中分离干细胞是一种新的尝试，最早由 McElreavey KD 等在 1991 年发现人
10、脐带中存在纤维母细胞样细胞，其后又有进一步的研究报告证实了间质干细胞的存在3 。我们的研究也表明人脐带 Whartons 胶干细胞(Whartons jelly mesenchymal stem cells，WMSC) 具有前软骨细胞的特性，表现在它表达型胶原和 SOX-9 基因，并可在生物反应器培养中形成类软骨组织4 ，本研究是进一步探讨从 WMSC 在体外诱导分化成软骨细胞时可能产生的分子变化，采用蛋白抗体芯片方法对 79 种细胞因子及生长因子进行观察和对比，为应用人脐带 Wharton 胶间质干细胞诱导产生的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的优缺点及临床应用时的参考。1 材料与方法取新鲜
11、足月顺产胎儿的脐带两条，命名 WSC-1，WSC-2 ，小心分离脐带血管组织和脐带外膜组织，即可获得脐带 Wharton 胶；5采用胶原酶消化法，快速获得大量成纤维细胞样形态的干细胞，脐带 Wharton 胶干细胞原代培养时间约为 35 d，CFU-F 频率约为3104，流式细胞仪检测脐带 Wharton 胶干细胞阳性表达CD44、CD105、CD271，而不含表达 CD34、CD45 造血干细胞标志，详细方法同前。WMSC-1，WMSC-2 均向软骨诱导分化，按照以下培养体系和培养条件进行：培养体系为：DMEM(20%FBS)加入 10 ngml hTGF-1， 10 ngml hFGF，体
12、积分数为 1%ITS 和 1.010-8 molL 地塞米松；培养条件：培养温度为 37、在 5%CO2 的培养箱内进行培养，每 3 d 换液。软骨细胞的鉴定方法同前。分别命名为 WSCC-1，WSCC-2。WSCC-1，WSCC-2 的免疫组化鉴定方法及 RT-PCR 方法见前 4 。上述 4 株细胞扩增至 107，开始进行蛋白芯片细胞因子检测，采用康成公司 RayBio人细胞因子抗体芯片，共 79 种，其中属于白细胞因子(interleukine)17 种，趋化因子 (chemokine)28 种，生长因子 10 种，骨软骨血管相关因子 6 种，免疫调节因子 4 种，此外还有酶抑制因子，肿
13、瘤生长抑制因子等；具体操作步骤如下：1.1 蛋白质抽提及 BCA 法蛋白质定量，按康成试剂盒进行。61.2 细胞因子检测1.2.1 试剂从康成公司购买 RayBio人细胞因子抗体芯片试剂盒1.2.2 仪器脱色摇床( 兴化仪器厂) ，扫描仪(Uniscan D1000 清华紫光股份有限公司)，图像分析软件：scanAlyze1.2.3 操作步骤1.2.3.1 封闭和孵育(1)将膜放入反应盒(“-”表示抗体包被面 )。(2)加入 2 ml 1x 封闭缓冲液，室温孵育 30 min。(3)去除封闭缓冲液，加入 1 ml 样品室温孵育 12 h。(事先用 1x 封闭缓冲液稀释样品裂解液使其 1 ml
14、的蛋白含量在 50500 ug 之间。)7(4)去除样品溶液，1x 洗液 I 洗膜 3 次。每次加入 2 ml 1x 洗液 I 室温洗膜 5 min。20x 洗液 I 用双蒸水稀释。(5)1x 洗液洗膜 2 次。每次加入 2 m1 1x 洗液室温洗膜 5 min。重复 1 次。20 x 洗液用双蒸水稀释。(6)准备一抗工作液。加 100 ul 1x 封闭液至生物素标记抗体管中。轻轻混匀并将混合液转移到装有 2 ml 1x 封闭液的管中。(7)每张膜加入 1 ml 已稀释的生物素标记抗体。室温孵育 12 h。(8)洗膜。重复上述 4、5 步骤。(9)每张膜加入 2 ml 1 000 倍稀释的 H
15、RP 标记的抗链霉生物素抗体。(如取 2 ul 1 000xHRP 标记的抗链霉生物素抗体加到 1 998 ul 1x 封闭缓冲液中)(10)室温孵育 2 h。(11)洗膜。重复上述 4、5 步骤。81.2.3.2 检测检测反应完成后，将膜夹在两塑料薄膜之间，去除膜上过量检测试剂，X 线胶片曝光。X-射线胶片曝光后，将胶片上的图像用扫描仪扫描并转换为灰度 TIFF 格式的图片文件保存。运行ScanAlyze 软件，将灰度 TIFF 格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为 Microsoft Excel 文件。2 结果2.1 间质干细胞鉴定经流式细胞仪分析表明，WMSC 不表达造血干
16、细胞标志(CD34 及 CD4）而表达黏附分子和间质细胞标志(CD44、CD105、CD271） ；HLA-ABC 阳性表达，HLA-DPDQDR阴性表达，与骨髓、脂肪等间质干细胞特点相同。不同代人脐带 Wharton 胶 MSCs 以低密度接种到 6 孔板 10 d 后，形成散在分布的集落，集落大小形态各不相同，细胞呈旋涡状分布。人脐带 Wharton 胶 WMSCs 第 2 代集落形成率为(0.3 0000.0 392)、4 代(0.2 9750.0 378)和 8 代(0.2 8000.0 316)，不同代间集落形成率差异无统计学意义(P0.05)。有限稀释法检9测 CFU-F 形成数，显示随着细胞接种密度的增加，克隆数也随之增加。2.2 诱导软骨细胞的鉴定2.2.1 向软骨细胞诱导培养后密集的细胞胞内、胞外番红“0”染色强阳性(图 1a)；2.2.
