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1、1糖皮质激素预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用作者：王升儒，成少利，国荣，刘健，李玲，王明永，许洁，芮俊，钱立雄，高珂【摘要 】 目的 探讨糖皮质激素对心肌缺血 再灌注损伤的保护作用。方法 将 18 只家兔应用冠状动脉左前降支结扎术造成心肌缺血模型，随机分成 3 组：心肌缺血再灌注损伤模型组 (模型组) 、糖皮质激素一次大剂量保护组(大剂量组) 以及糖皮质激素多次小剂量保护组(小剂量组 )，每组 6 只。应用 BL420 生物信号采集系统观察记录心电图 ST 段改变，分别在缺血前、缺血 15min 以及再灌注 30min 取血测定血浆丙二醛 (MDA)浓度；缺血区心肌标本制作冰冻切片，行组
2、织化学染色，观察缺血区琥珀酸脱氢酶活性变化。结果 糖皮质激素的大、小剂量保护组再灌注过程中 ST 段恢复的时间较短，快于模型组；大剂量组血清 MDA 水平低于小剂量组(P0.05)，且两组均低于模型组(P0.01)；大剂量组缺血心肌琥珀酸脱氢酶活性高于小剂量组，且两组均明显高于模型组。结论 糖皮质激素对心肌缺血 再灌注损伤可以起到有效的保护作用，一次大剂量的治疗保护效果要好于多次小剂量。 2【关键词】 糖皮质激素 心肌 缺血 再灌注损伤 家ABSTRACT: Objective To study the protective effect of glucocorticoid precondit
3、ioning on the myocardial ischemic and reperfused hearts. Methods Totally 18 rabbits were randomly divided into three groups: myocardial ischemiareperfusion model (model), highdose glucocorticoid given by one time group (highdose group) and lowdose glucocorticoid given by several times group (lowdose
4、 group), with six rabbits in each group. Myocardial ischemia was induced by left anterior descending coronary artery ligation. ST segments were recorded by the BL420 biological signal acquisition system. Plasma malondial dehyde (MDA) was examined before ischemia, at 15min after ischemia and 30min af
5、ter reperfusion; ischemic heart muscles were prepared with cryotomy and stained histochemically. Succinic dehydrogenase activity was observed in the ischemic region. Results There was shorter time of STsegment recovery in the highdose group and the lowdose group than that in the model group. Serum l
6、evel of MDA in the highdose group was lower than in the lowdose group (P0.05), and both were also lower than that in the model 3group (P0.01). The succinate dehydrogenase activity in the highdose group was significantly stronger than in the lowdose group, and both were significantly stronger than th
7、at in the model. Conclusion Glucocorticoid plays an effectively protective role in myocardial ischemiareperfusion injury. The protective effect of high dose is better than lowdose therapy.KEY WORDS: glucocorticoid; cardiac muscle; ischemica reperfusion injury; rabbit研究表明再灌注损伤的主要机制是钙超载、自由基损伤及微循环障碍。近年
8、来已有多项研究证实，中性粒细胞等产生的自由基以及炎症因子使细胞膜脂质过氧化在缺血 再灌注损伤中起着重要作用，最终导致细胞坏死和凋亡1。糖皮质激素有抑制氧自由基的释放、抗休克、稳定细胞膜的作用2，其可抑制中性粒细胞的黏附性、趋化性、分泌功能及花生四烯酸的代谢，减少中性粒细胞对组织细胞的损伤3。本研究应用糖皮质激素预处理对家兔心肌缺血再灌注损伤进行保护治疗，以了解糖皮质激素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，为临床减轻心肌缺血 再灌注损伤的发生提供实验依据。41 材料与方法1.1 实验动物体重(2.50.1)kg 的健康家兔 18 只 (雌雄各半) ，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1.2 试剂
9、及仪器地塞米松注射剂(江苏黄海制药有限公司)；TBA(硫代巴比妥酸，上海远帆助剂厂)；甲醇、四乙氧基丙烷、正丁醇溶液、200mL/L 三氯醋酸(TCA)等均为分析纯制剂。 BL420 生物信号采集系统(成都泰盟科技有限公司) 。1.3 心肌缺血模型的制作及分组家兔在相同条件下饲养 3d 后随机分为 3 组(雌雄各半)：模型组、一次大剂量糖皮质激素保护组(大剂量组)以及多次小剂量保护组(小剂量组) ，每组 6 只。所有家兔术前 12h 禁食。手术步骤：静注 200g/L 乌拉坦(5mL/kg) 麻醉，分离颈部气管，连接呼吸机；左颈总动脉插管，与 BL420 系统相连记录血压，同时接通心电图联线记
10、录 ECG；开胸暴露心脏，分离冠状动脉左前5壁支，在其下穿线，平衡 5min 后，活结结扎冠状动脉左前壁支，以心电图 ST 段弓背上抬大于 2mV、T 波高耸、结扎部位以下心肌组织发绀为心肌缺血造模成功的标志。缺血 20min 后，松开结扎线，以 ST 段下降 1/2、心肌颜色恢复为再灌注成功。一般需要灌注20min。小剂量组于造模手术前连续 3d 耳缘静脉注射地塞米松0.6mg/kg 体重，每天 2 次；大剂量组于结扎冠状动脉 10min 前静注大剂量地塞米松 20mg/kg 体重；模型组注射等量生理盐水。3组动物分别在缺血前、缺血 15min、再灌注 30min 时各采集颈内静脉血 3mL
11、，4、2000r/min 离心 15min，取血清-20保存待测定丙二醛(MDA)含量。再灌注 2h 时处死动物，取心肌组织液氮保存待做冰冻切片。1.4 血清 MDA 的测定TBA 用蒸馏水配成 6.7g/L 水溶液(50水溶或室温下溶解)，用甲醇溶解的四乙氧基丙烷标准贮备液(10mol/L)及标准应用液(10nmol/L)备用。将所取血清或标准液或生理盐水 0.3mL，加入200mL/L 的 TCA 2.5mL，边加边摇，混匀；加入 6.7g/L TBA 1.0mL，再次混匀，加盖；沸水浴 30min，流水冷却至室温；加入正丁醇 4.0mL，振荡或颠倒混匀数次；5000r/min 离心 10
12、min，吸6取上清液于 535nm 比色。结果计算：MDA(mmol/L)=(f/F)10(F：由标准应用液测得的吸光度值； f：由样品溶液测得的吸光度值)。1.5 琥珀酸脱氢酶组化染色心肌组织标本冰冻切片，厚度为 6m。琥珀酸脱氢酶组织化学染色方法为 NitroBT 法4。切片浸于 37 恒温水浴箱的孵育液中孵育 25min孵育液成分： 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.6)、0.1moL/L 琥珀酸钠、1.0g/L NitroBT 各 10mL。再将切片固定于 100mL/L 甲醛溶液中 10min，流水轻轻冲洗 1min，用 PB 封片观察。同时各组均作 HE 染色观察形态学改变。
13、1.6 统计学处理所有数据以均数标准差(s) 表示。应用 SPSS10.0 统计软件行组间方差分析和 t 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 血清 MDA 含量7应用糖皮质激素的两个保护组再灌注 30min 时血清 MDA 含量低于模型组(P0.01)；而且大剂量组 MDA 水平低于小剂量组(P0.05，表 1)。表 1 3 组血清 MDA 含量的比较（略）2.2 心肌组织的病理变化大剂量组心肌纤维排列整齐，未见明显异常改变，仅见轻度纤维肿胀；小剂量组心肌纤维排列稀疏，心肌纤维出现早期凝固性坏死改变，肌质红染，颜色加深，呈不规则变化；模型组心肌纤维排列紊乱，纤维间空隙加
14、大，大部分心肌纤维凝固性坏死，核消失(图 1)。2.3 琥珀酸脱氢酶的组化染色结果琥珀酸脱氢酶阳性染色为蓝色。大剂量组心肌纤维排列紧密，结构无异常表现，阳性染色很深，呈粗块状；保护组心肌结构已无明显异常，阳性染色与大剂量组相比明显减弱，呈细粒状；模型组心肌结构疏松，肌纤维萎缩，甚至出现空泡，阳性染色与前两组比较均减弱(图 2)。3 讨 论8抗炎、稳定膜结构是糖皮质激素的重要作用之一。本研究在家兔心肌缺血 再灌注损伤模型制作前应用糖皮质激素地塞米松，结果显示应用糖皮质激素的两组心电图 ST 段恢复的时间比对照组明显缩短，提示糖皮质激素可以对心肌缺血 再灌注损伤起到预保护作用。文献报道5心肌病变时
15、常有心肌酶的改变，其中之一是琥珀酸脱氢酶。琥珀酸脱氢酶是三羧循环中与细胞氧化及线粒体氧化磷酸化有关的重要酶，主要分布于线粒体内膜和嵴上，是线粒体的标志酶。其活性变化常与线粒体的损伤同时出现，可作为缺血性心肌病变的指标之一5。在缺血及再灌注过程中心肌细胞线粒体受到损伤，其内的琥珀酸脱氢酶的活性降低，组织化学染色可反映其受损的程度。本研究组织化学染色结果显示，模型组琥珀酸脱氢酶染色最浅，其活性低于应用糖皮质激素预处理的两组，提示细胞损伤较重。另外大剂量组标本的染色强于小剂量组，提示大剂量一次冲击给药较多次小剂量的保护效应更好。心肌缺血再灌注时经多种途径产生大量氧自由基，而超氧化歧化酶(SOD) 等
16、清除自由基的物质相对不足，使细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸和脂肪酸的不饱和双键极易受到氧自由基攻击，导致脂质过氧化反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物MDA。MDA 含量可间接反应自由基产生量和膜脂质过氧化程度6。9本实验结果显示应用糖皮质激素保护的两组，再灌注后 MDA 水平明显低于模型组(P0.01)，提示糖皮质激素使自由基损伤作用减轻，代谢产物 MDA 减少。综上所述，糖皮质激素对兔心肌缺血再灌损伤具有显著的保护作用，而且大剂量单次冲击治疗的预保护效果优于小剂量多次给药。其主要的机制可能与改善线粒体功能和降低自由基损伤有关，但具体的作用机制还需要进一步研究。【参考文献】1 马中富，马虹，叶任高，等 . 急性心肌梗死猝死患者心肌细胞凋亡的研究 J. 中国危重病急救医学, 2000, 12(3):137141.2KAWAMURA T, INADA K, OKAD
