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1、1粪钙卫蛋白在溃疡性结肠炎诊断中的价值研究【摘要】 目的 研究粪钙卫蛋白检测作为一种无创性方法用于诊断溃疡性结肠炎(UC)活动性的价值。方法 UC 患者 72 例，60 例经结肠镜检查正常的患者作为对照，留取结肠镜检查后 1 周内的粪便样本 10 g，采用 ELISA 方法进行粪钙卫蛋白检测，对 19 例活动期 3级患者实施随访，监测粪钙卫蛋白水平变化。结果 粪钙卫蛋白水平差异在 UC 缓解期组和正常对照组之间无统计学意义，活动期组与缓解期组及活动期组和正常对照组之间均有统计学意义(597.2 g/g vs 7.9 g/g，6.7g/g，P0.01)。活动期 1 级(109.5 g/g)、2
2、级(587.9 g/g)和 3 级(1331.6 g/g)两两之间比较差异均有统计学意义(P0.01)。粪钙卫蛋白水平与 UC 内镜分级显著相关(r=0.89，P0.01)，19 例 UC 活动期 3 级患者经治疗后至缓解期，粪钙卫蛋白水平显著下降，其治疗前后相比差异有统计学意义(1378.5 g/g vs 8.7 g/g，P0.01)。结论 粪钙卫蛋白水平可以较准确地反映 UC 患者所处不同时期 (活动期或缓解期)以及活动期的不同严重程度(活动期 1.2.3 级)，能较好地应用于临床诊断、观察疗效并指导用药。 【关键词】 钙卫蛋白;溃疡性结肠炎;ELISAAbstract Objective
3、 To research the value of fecal 2calprotectin as a non-invasive marker of disease activity in ulcerative colitis (UC).Methods We recruited 60 control patients and 72 patients with UC. A11 the patients were asked to collect 10g fecal samples in 1 wk after colonoscopy. An ELISA (enzyme linked immunoso
4、rbent assay) was used to determine fecal calprotectin. 19 patients whose UC activity at 3 grade after medical therepy were conduct follow-up visits, to guide clinical therapy and observe effects based by the level of fecal calprotectin.Results There was no significant difference in fecal calprotecti
5、n level between the inactive UC and control groups. There are significant difference in fecal calprotectin level between patients with active and inactive UC(597.2g/g vs 7.9g/g， PKey words Calprotectin;Ulcerative colitis;ELISA溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC) 是常见的慢性炎症性肠道疾病，其病因与发病机制尚不十分清楚1，普遍认为与机体免疫应答、肠黏
6、膜免疫识别失调2及个体遗传易感性有关。当前诊断UC 活动性主要依靠结肠镜检查，有研究认为 UC 内镜下的活动性可反映疾病严重性3,4，但患者依从性较差。外周血 WBC，PLT, CRP, IgG，ESR 等虽可用于诊断 UC 的活动性，但敏感度不高。钙3卫蛋白(calprotectin)是一种杂合性的钙结合蛋白，具有耐热性和抗蛋白酶活性，在肠腔和外界环境中可长期保持相对稳定而不被酶和细菌所破坏5，其主要生物学功能包括：抗微生物活性，免疫调节作用; 参与细胞信号传递; 抗增殖和诱导细胞凋亡，炎症反应中调节蛋白等。它是中性粒细胞和活化巨嗜细胞胞质中的重要蛋白质，可作为一种炎性标志物6。国外资料研究
7、表明，粪便中钙卫蛋白的稳定性要好于其它粪便生物标记物，其浓度在 UC 活动期显著增加7。本试验中，我们检测 UC 患者不同时期的粪钙卫蛋白含量并与血液指标 WBC， PLT, CRP, IgG，ESR 相比较，研究是否可把它作为溃疡性结肠炎的诊断指标、疗效观察和治疗方案调整的依据。1 材料和方法1.1 材料 2007 年 1 月至 2008 年 9 月符合 2000 年成都会议标准8确诊的 UC 患者 72 例，男 35 例，女 37 例，平均年龄41(2569)岁。随访活动期 3 级患者 19 例至缓解期后均重复结肠镜检查和粪便标本采集，一共进行结肠镜检查 91 次，组织活检 91份，采集粪
8、便标本 91 份。选用肠镜及活检正常的 60 例患者为对照组。肝、肾功能及血液指标 WBC，PLT, CRP, IgG，ESR 均正常，男 23 例，女 37 例，平均年龄 42(1870)岁。入选者均无明显上消化道症状及胃和小肠疾患，无严重心、肺、肝、胰、肾和神经、精神疾病，近 1 个月内未曾应用过糖皮质激素和免疫抑制剂，并排4除孕妇、药瘾者、长期使用非甾体抗炎药及质子泵抑制剂者9、类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者、酗酒者等。UC 患者依据Truelove 内镜分级标准被分为缓解期、活动 1，2，3 级，留取患者肠镜检查 1 周内的粪便， 2 h 内送至医院，密封后置于-20保存，以备钙卫
9、蛋白检测。所有入选者在肠镜检查当日行肝、肾功能及WBC，PET,CRP,IgG，ESR 检测，肠镜检查时均取活检，病理诊断采用 TrueloveWiffs 标准10，人粪钙卫蛋白检测 ELISA 试剂盒购自芬兰 Hycult 公司，酶标仪为 USA BioRad 550 型。1.2 方法 将留存粪便在室温解冻后，用取样环取约50150 mg，放入螺口试管中一并称其质量，计算出粪便的净含量，按照质量/容积(kg/L)=150 的比例加入萃取液，充分震荡 20 min 混匀后取 1 mL 匀浆离心 10000 g 20 min，取上清液 0.5 mL留存备用，-20 保存 ,酶联免疫反应严格按照人
10、粪钙卫蛋白检测ELISA 试剂盒说明书进行，将钙卫蛋白提取液室温解冻，以 110比例稀释，常规 ELISA 操作程序( 双抗体夹心法)。将酶标仪设置为450 nm 进行测定，标准品包括 7 个质量浓度(100，50 ，25 ，12.5，6.25，3.13，1.56 g/L)，最高浓度标准液的光密度值为 2.373，以 110 比例稀释的标本若超出标准曲线范围没有被测出，则需进一步扩大稀释比例直至测出为止。1.3 统计学处理 计算样本的中位数和四分位间距。两组间比5较用 MannWhitney U 检验，相关系数用 Spearman 相关分析计算并进行检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结
11、 果2.1 UC 活动性与粪钙卫蛋白、血 IgG 和 CRP 活动期粪钙卫蛋白水平显著高于缓解期和正常对照组(P0.05)，活动期各级之间差异均有统计学义。19 例活动期 3 级患者治疗后至缓解期，粪钙卫蛋白水平显著下降，其治疗前后差异有统计学意义(1378.5 g/g vs 8.7 g/g，P0.01)。粪钙卫蛋白与肠镜分级显著相关(r=0.89，P0.01)。缓解期 IgG，CRP 与对照组之间差异无统计学意义(0.05) ，活动期 IgG 和 CRP 水平高于缓解期和正常对照组(P0.01)。IgG 活动期各级之间差异均有统计学意义，CRP 活动期 2、3 级之间差异无统计学意义，IgG
12、，CRP 与肠镜分级相关(r=0.97，0.96，P0.05) ，活动期 PLT，ESR，WBC 水平高于缓解期和正常对照组(P0.01) ，PLT 活动期各级之间差异均有统计学意义，ESR 活动期 1、2 级之间差异无统计学意义，WBC 活动期各级之间差异均无统计学意义，6PLT，ESR，WBC 与肠镜分级相关(r=0.98，0.99，0.97，P0.01)(表 3)。表 1 粪钙卫蛋白测定结果表 2 UC 患者粪钙卫蛋白、血 IgG，CRP 的检测结果表 3 UC 患者血 WBC， PLT, ESR 检测结果3 讨 论钙卫蛋白最早在 1980 年从中性粒细胞和单核细胞中分离出来，广泛分布于
13、人体组织、体液及细胞中，是一种重要的炎症反应性蛋白。UC 为结肠慢性炎症，故粪便炎性标志物比血清标志物能更敏感地反映肠道炎症程度。粪钙卫蛋白是稳定而又活化的炎性生物标记物，故可以用来判断 UC 的活动性。在本实验中，患者肠道炎症程度按内镜分级标准进行分级。粪钙卫蛋白含量在活动期为597.2 g/g，缓解期为 7.9 g/g，对照组为 6.7 g/g，这与国外研究基本吻合11 ，粪钙卫蛋白检测可准确地诊断 UC 的活动期和缓解期，并能反映病情动态变化。目前，血液指标 WBC、PLT 、CRP、IgG 及 ESR 常用于 UC活动性的诊断。我们发现，活动期 CRP 水平高于缓解期和正常对照，和以往
14、研究结果相近12，诊断 UC 活动性的敏感度为 64%，诊断UC 活动期 2，3 级的敏感度优于 1 级。活动期 IgG 水平与缓解期和正常对照均有差异，提示活动期 UC 患者体内免疫功能失调紊乱，7诊断 UC 活动性的敏感度为 46.6%，诊断 UC 活动期 1，2 级的敏感度较差。活动期 PLT 水平高于缓解期和正常对照，与 Chiarantini 13等的研究结果相一致，证明活动期 UC 患者体内血液呈高凝状态，易发生血管栓塞，诊断 UC 活动性的敏感度为 45.3%，对活动期 3 级的敏感度较好。活动期 ESR 水平与缓解期和正常对照均有差异，国外也有相同报道14，诊断 UC 活动性的
15、敏感度为 24%，对活动期 1，2，3 级的敏感度均不高，但相对于 3 级较敏感。活动期WBC 水平与缓解期和正常对照存在差异15，诊断 UC 活动性的敏感度为 13.3%，对活动期 1，2，3 级敏感度均差。上述血液指标易受全身因素的影响，对肠道病变的敏感度较低，升高时常见于重症患者，故诊断 UC 活动性的价值不高。与血液指标相比，粪钙卫蛋白在 UC 活动期显著高于缓解期和正常对照，活动期各级之间差异也均有统计学意义，与 UC 内镜分级标准的相关性极高 16，明显高于上述各项指标;诊断 UC 活动性的敏感度为 98.7%，对 UC 活动期各级均高度敏感，经 2 检验，粪钙卫蛋白诊断 UC 活动性的敏感度与其他血液指标差异均有统计学意义(P0.01)，显著高于其他指标。本研究表明，UC 活动期 3 级患者及时调整治疗方案后，病情好转者，粪钙卫蛋白水平随之逐渐下降;若病情不缓解，粪钙卫蛋白水平仍持续偏高，进一步调整方案后，随着临床症状的改善，粪钙卫蛋白水平亦最终降至较低水平，此表现与肠镜复查结果高度一致。那些治疗后粪钙卫蛋白含量始终处在较低水平者，只需维持治8疗，不调整治疗方案，其病情亦能长期保持相对稳定。可见，粪钙卫蛋白检测用于 UC 各期临床治疗用药指导，一方面有利于医生对疾病的动态变化进行监控，另一方面大大减轻患者痛苦和降低治疗费用，在一定程度上
