TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)

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1、 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法) 产品编号 产品名称 包装 C1091 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法) 20次 产品简介： 碧云天生产的显色法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组D

2、NA断裂时，暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是本试剂盒通过TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。 本试剂盒有如下优点。(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到

3、细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。(2) 特异性好：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。 (4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死

4、细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。 本试剂盒足够检测20个样品。 包装清单： 产品编号 产品名称 包装 C1091-1 TdT酶 40l C1091-2 Biotin-dUTP 960l C1091-3 TdT酶稀释液(选用) 500l C1091-4 Streptavidin-HRP 22l C1091-5 Streptavidin-HRP稀释液 1ml C1091-6 DAB显色液A 6ml C1091-7 DAB显色液B 6mC1091-8 标记反应终止液 6ml 说明书 1份 保存条件： -20保存。DAB显色液A和DAB显色液

5、B需避光保存。 注意事项： 需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126)等适当的封片液，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098)，同时需自备含0.1% Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)。 需自备过氧化氢，除石蜡切片外需自备甲醇。 如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K和二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 对于贴壁细胞或细胞涂片： a. 用PBS或HBSS洗涤1次。 b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更

6、牢。 c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d. 用PBS或HBSS洗涤1次。 e. 加入含0.1 Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 f. 用PBS或HBSS洗涤1次。 g. 在用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。 h. 转步骤5。 2. 对于悬浮细胞或细胞悬液： a. 收集细胞(不超过200万细胞)，用PBS或HBSS洗涤1次。 b. 涂片，使细胞粘附在载玻片上。可

7、以干燥样品使细胞贴得更牢，或使用适当的粘附试剂。 c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d. 用PBS或HBSS洗涤1次。 e. 用含0.1 Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 f. 用PBS或HBSS洗涤1次。 g. 在用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。 h. 转步骤5。 3. 对于石蜡切片： a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无

8、水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。 b. 滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。 c. 用PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 d. 在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3% H2O2in PBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。 e. 转步骤5。 4. 对于冷冻切片： a. 用4%

9、多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 b. 用PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。 c. 加入含0.1 Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 d. 在用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。 e. 转步骤5。 5. 配制生物素标记液： 参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。 1个样品 5个样品 10个样品 TdT酶 2l 1

10、0l 20l Biotin-dUTP 48l 240l 480l 生物素标记液 50l 250l 500l 6. 样品的生物素标记： a. 在样品上加50l 生物素标记液，37孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。 b. 用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。 c. 用PBS或HBSS洗涤3次。 7. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制： a. Streptavidin-HRP工作液的配制： 参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意

11、：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。 1个样品 5个样品 10个样品 Streptavidin-HRP 1l 5l 10l Streptavidin-HRP稀释液 49l 245l 490l Streptavidin-HRP工作液 50l 250l 500l b. DAB显色液的配制： 按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。等体积混合适量DAB显色液A和DAB显色液B，充分混匀后即为DAB显色液。注意：配制好的DAB显色液必须一次使用完毕，不宜冻存。 8. 样品的DAB显色： a. 在样品上加50l Streptavidin

12、-HRP工作液，室温孵育30分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少Streptavidin-HRP工作液的蒸发。 b. 用PBS或HBSS洗涤3次。 c. 滴加0.2-0.5mlDAB显色液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。 d. 用PBS或HBSS洗涤3次。 e. 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液(C0107)或甲基绿染色液(C0115)进行细胞核染色。随后用PBS或HBSS洗涤3次。 f. 直接进行观察，或用95%乙醇脱水5分钟，再用100%乙醇脱

13、水2次，每次约3分钟，再用甲苯透明2次，每次5分钟，随后封片观察。染色结果可参考下图： 小鼠卵巢切片TUNEL检测DAB显色结果 棕色为TUNEL染色阳性的凋亡细胞，蓝色为被苏木素染色的细胞核。 常见问题： 1. 出现非特异性显色。 a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的显色。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。 b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。 c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞

14、或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性染色。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。 2. 染色背景很高。 a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。支原体染色检测试剂盒(C0296)可以向碧云天订购。 b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。 d. 细胞内的过氧化物酶灭活不充分会导致很多细胞呈现阳性染色，改进过氧化物酶的灭活方法，例如延长灭活时间等会有所帮助。 e. 所使用的溶液有DNA酶污染。DNA酶污染导致的随即切割会导致产生一定的背景并干扰检测。把溶液高压灭菌可以有效灭活各种常见DNA酶。 3. 标记效率低。 a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。 b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。