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1、1硫化氢对多器官功能障碍综合征大鼠的保护作用作者：刘浩，席孝忠，程永刚，李洁，曹永孝【摘要 】 目的 探讨硫化氢(H2S)对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠脏器的保护作用。方法 SD 大鼠 40 只，随机分为：正常对照组;MODS 造模 12h 组;MODS 造模 24h 组;硫氢化钠(NaHS)保护 12h 组;NaHS 保护 24h 组。试剂盒法检测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx) 、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、肌酸激酶(CK) 和肌酐(Cr)的含量，观察各组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的病理组织学变化。结果 H2S 保护组大
2、鼠血清 SOD、GSHPx 明显增高(P0.05)，MDA 、ALT、CK 和 Cr 的含量明显降低(P0.05，P0.01);H2S 保护组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分较模型组明显改善(P0.05)。结论 H2S 具有明显的抗炎和器官保护作用，对大鼠 MODS 受损脏器具有保护作用。【关键词】 硫化氢;硫氢化钠;多器官功能障碍综合征;大鼠ABSTRACT: Objective To investigate the possible protective effects of hydrogen sulfide (H2S) on rats with 2multiple organ
3、dysfunction syndrome (MODS). Methods NaHS was taken as a donor of H2S. Forty SpragueDawley rats were divided into 5 groups with 8 rats in each group: sham group, MODS 12h model group, MODS 24h model group, NaHS protection 12h and 24h groups. The content of superoxidase dismutase (SOD), malondialdehy
4、de (MDA), glutathione peroxidase (GSHPx), alanime transaminse (ALT), creatine kinase (CK) and creatinine (Cr) in serum were measured, respectively. The histopathological changes in the heart, liver, lung, kidney and small intestine were observed. Results The serum content of SOD and GSHPx was signif
5、icantly higher in protected H2S groups (P0.05), while MDA, ALT, CK and Cr were significantly lower in protected H2S groups (P0.05, P0.01). Organ injury comprehensive scores were significantly higher in MODS groups than in normal groups (P0.01); organ injury comprehensive scores were significantly lo
6、wer in protected H2S groups than in MODS groups (P0.05). Conclusion H2S has obvious protective effects on rats with MODS; thus it can protect the MODSlesioned organs of rats.KEY WORDS: hydrogen sulfide; NaHS; multiple organ 3dysfunction syndrome (MODS); rat多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndr
7、ome, MODS)是临床重症患者死亡的主要原因之一，目前尚缺乏有效的治疗方法。内源性硫化氢(H2S)具有清除氧自由基，抑制炎症反应等作用1;外源性 H2S 对肺缺血再灌注损伤、肠缺血再灌注损伤等具有一定的保护作用23 。但 H2S 对 MODS 是否具有保护作用尚不清楚。本研究通过大鼠盲肠造瘘制作多器官功能衰竭模型，探讨 H2S 对 MODS 可能的保护作用。1 材料与方法1.1 实验动物及试剂1.1.1 实验动物 健康成年 SD 大鼠 40 只，雌雄各半，体重(25010)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1.1.2 试剂和药品 硫化氢钠(NaHS)购自美国 Sigma 公司;超氧
8、化物歧化酶(superoxidase dismutase, SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)试剂盒、血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)试剂盒、肌酸激酶(creatin 4kinase, CK)试剂盒和肌酐(creatinine, Cr)试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。1.1.3 主要实验仪器 T6 新世纪紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);超速离心机(北京医用离心机厂); 水浴箱(0100，杭州蓝天化验仪
9、器厂 )。1.2 方法1.2.1 MODS 动物模型的制作 参照竞氏等法4 。大鼠禁食过夜，200g/L 的乌拉坦(1g/kg 体重) 腹腔内注射，麻醉成功后，取平卧位，固定于手术台上。右下腹备皮、消毒，开腹并寻见盲肠后，在其中远 2/3 处结扎，嵌闭远端肠腔，用 16 号针头于盲肠末端戳孔 3 处，向腹腔内挤出肠内容物少许后，将盲肠放回腹腔原位，嵌闭的盲肠内容物将持续向腹腔溢出，常规缝合腹壁切口。术后皮下注射 50g/L 葡萄糖生理盐水 8mL，苏醒后能自由饮水进食者不再需皮下注射液体。1.2.2 实验分组 SD 大鼠随机分为 5 组，每组 8 只：正常对照组，不做任何处理，即采血待测;造模
10、型后 12h 组，盲肠结扎并造瘘 12h 后采血待测 ; 造模型后 24h 组，盲肠结扎并造瘘 24h后采血待测;给药保护 12h 组，在造模同时腹腔注射 NaHS 515mol/kg，12h 后采血待测;给药保护 24h 组，造模同时腹腔注射 NaHS 15mol/kg，24h 后采血待测。1.2.3 生化指标检测 经腹主动脉采血约 5mL，3000r/min离心 10min，取血清冻存待测。黄嘌呤氧化酶法测定血清 SOD 活力; 硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量;全自动分光光度仪测定血清ALT、CK 、Cr 值。测定过程按照试剂盒说明书操作。1.2.4 组织形态学观察 采血后立即处死大鼠，
11、取心、肝、肺、肾、小肠(距回盲部 10cm 处)组织，以 100g/L 多聚甲醛溶液室温下固定 24h，300g/L 蔗糖 4过夜沉底，OCT 包埋，恒冷箱冰冻切片，片厚 10m，室温干燥后常规 HE 染色。光镜下观察各器官组织学改变。由病理医师在未被告知标本分组的情况下，对每份标本进行定性评估，依损害程度分为正常和轻、中、重 4 级，分别对应评分 0、1、2、3 分。判定依据：标本大体形态、淤血程度和色泽;组织细胞损伤、坏死和炎细胞浸润程度;黏膜脱落和血管扩张程度。标本大体正常，毛细血管轻度淤血，组织细胞轻度水肿为轻度损伤(1 分);组织细胞大片气球样变，毛细血管扩张，内充满红细胞，可见炎细
12、胞聚集，黏膜脱落为中度损伤(2 分); 组织细胞浓缩，大量炎细胞聚集，红细胞逸出血管外，黏膜断裂坏死为重度损伤(3分)。61.2.5 统计学分析 实验数据以s 表示，应用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析。组间比较采用 t 检验，P0.05 表示差异有统计学意义。2 结 果MODS 造模后 12h 组和 24h 组大鼠血清中各项生化指标与正常对照组相比均有显著性变化(P0.01)，尤其是造模型后 24h组，大鼠血清各项生化指标检测结果符合 MODS 诊断标准5。2.1 H2S 对血清 SOD、MDA、GSHPx 活性的影响 与正常组相比，MODS 模型组 SOD 和 GSHPx明显降低。
13、与 MODS 模型组相比，H2S 保护组大鼠血清中 SOD、GSHPx 活性均明显升高，而 MDA 则明显降低(P0.05，表 1)。表 1 H2S 对 MODS大鼠血清中氧化指标的影响*P0.01 vs. normal group; P0.05 vs. model group at the same time2.2 H2S 对血清 ALT、CK 和 Cr 的影响 与正常组相比，MODS 模型组 ALT、CK 和 Cr 明显升高;与 MODS 模型组相比，H2S 保护组大鼠血清中 ALT、CK、Cr 水平显著降低(P0.05，P0.01，表 2)。表 2 H2S 对 MODS 大鼠血清中器官损
14、伤相关生化指标的影响72.3 H2S 对大鼠器官损伤综合评分的影响 与正常组相比，MODS 模型组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分均显著升高(P0.01);与同时间模型组相比，H2S 则能明显降低大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分(P0.05，表 3)。2.4 大鼠组织病理学改变 与正常组相比， MODS 造模后大鼠肺、肝、肾、小肠均有不同程度的损害，24h 模型组器官损害严重。肺可见肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔内有漏出红细胞，还可见含铁血黄素细胞(心衰细胞);肺间质水肿增厚，炎性细胞成片形浸润; 细支气管纤毛断裂、脱落等( 图 1A)。肾小管严重水肿，管腔闭塞，肾小球因血
15、流减少萎缩变小(图 1C)。小肠黏膜大片坏死，断裂脱落，黏膜下可见大量炎性细胞聚集(图 1E)。肝细胞弥漫性气球样变伴点状坏死，肝组织内淤血，可见炎细胞浸润(图 1G)。与 MODS 造模 24h 组比较，给药保护 24h 组大鼠的肺、肝、肾、小肠损伤均有不同程度的减轻。肺组织充血较前者明显减轻，仅见少量炎性细胞局限性浸润，肺间质明显减轻(图 1B);肾脏仅显示炎细胞浸润，肾小管轻度水肿，肾小球形态大致正常(图 1D);小肠黏膜水肿样变，轻度坏死，绒毛形态较规则(图 F);肝组织水肿较轻，少见坏死灶，细胞形态大致正常(图 1H)。表 3 各组大鼠的器官损伤综合评分83 讨 论MODS 的诱因可
16、分为感染性和非感染性，其中感染性约占70%。危重患者 MODS 发生率高，临床治疗效果不理想，死亡率可达 40%98%6。目前 MODS 的发病机制尚不完全清楚，可能与下列原因有关：机体内炎症反应与抗炎反应系统失衡;效应细胞分泌的炎症介质产生“瀑布式”级联放大炎症效应，诱发组织缺血缺氧; 实质细胞变性坏死及凋亡，器官生理功能丧失。强烈的炎症反应，可造成组织内缺血缺氧，细胞内有氧代谢受到抑制，ATP 合成急剧下降，加之无氧代谢产生的有毒酸性产物和氧自由基大量累积，导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏。当严重缺血时可使细胞内环境紊乱，甚至细胞死亡，继而出现器官功能衰竭7。本实验采用盲肠结扎造瘘致腹腔持续性感染引发大鼠MODS，符合临床感染性 MODS 的发病特点。目前，国内对于 MODS 治疗方面的研究多着重于中医中药，如大黄、清开灵、热毒清等的使用8。如能针对 MOD
