《矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成型胶原的实验研究作者：袁芳，李厚轩，金峰，郑瑜谦，闫福华【摘要 】 目的 观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）在裸鼠体内形成型胶原，为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。 方法 体外分离培养Beagle 犬 BMSCs，经冻存 12 个月后，在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成 BMSCs胶原膜支架复合物，将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架(空白对照组)、2 种 BMSCs胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中，术后第4 周行组织病理学和免疫组织化学观察，分析各组标本中的型胶原形成
2、量。 结果 空白对照组植入胶原膜后，新生胶原分布很少；非矿化诱导组胶原分布明显增多；矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示，矿化诱导组(0.19630.0126)非矿化诱导组(0.14890.0037)空白对照组(0.07750.0058)（P0.05） 。 结论 矿化诱导培养能够促进冻存的 BMSCs 在裸鼠体内形成型胶原。 【关键词】 低温保存； 骨髓细胞； 型胶原； 牙周组织； 组织免疫组织化学2ABSTRACT: Objective To explore the effects of osteoinductive culture on the synthesis
3、of type collagen by bone marrow stromal cells (BMSCs) in nude mice. Methods BMSCs from beagle dogs were harvested and cryopreserved for 12 months. Recovered BMSCs were combined with collagen scaffold in vitro in osteoinductive or nonosteoinductive culture medium. Osteoinductive conditioned collagen
4、scaffold alone, osteoinduced and noninduced BMSCsscaffold complex were respectively implanted into the subcutaneous tissues of nude mice for 4 weeks. Type collagen formation was evaluated by H&E staining and immunohistochemistry(IHC). Results Scarce collagen fibers were observed in the group implant
5、ed with collagen scaffold alone, moderate collagen fibers in noninduced BMSCsscaffold group, and large quantities of newly formed collagen fibers in osteoinduced BMSCsscaffold group. Enhanced formation of type collagen was observed in osteoinduced BMSCsscaffold group (0.19630.0126), with lesser form
6、ation in noninduced BMSCsscaffold group (0.14890.0037) and scaffold alone group(0.07750.0058)（P0.05 ）. Conclusion 3Osteoinductive culture can enhance type collagen formation in nude mice by cryopreserved BMSCs.KEY WORDS: cryopreservation； bone marrow cells； collagen type ； periodontium； immunohistoc
7、hemistry； disease models,animal骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs) 是一种能分化为成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种类型细胞的多能干细胞，在骨组织、软骨组织以及牙周组织缺损的再生医学中有着广泛的应用前景1 。本课题组前期研究发现，冻存 BMSCs 复苏传代后，在体外培养条件下仍保持了较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力，并且具有未冻存细胞相似的体内促进牙周组织再生的能力23 。寻找适宜的细胞培养条件对于牙周再生医学有着重要意义。因此，本实验拟研究矿化诱导培养能否促进冻存后的BMSCs 在裸鼠体内形成型胶原，从而为选
8、择适宜培养条件、提高BMSCs 体内再生牙周组织的能力提供参考。1 材料和方法1.1 实验动物及主要试剂4健康成年 Beagle 雌性犬（体质量 11 kg)、BALB/c 裸鼠 42只(46 周，体质量 1823 g)；新生牛血清(江滨生物，杭州)；DMEM(Gibco，美国) ；地塞米松、维生素 C 和 甘油磷酸钠(Sigma，美国)；BME10X 医用胶原膜 (北京中国医学科学院生物医学工程研究所)；型胶原抗体、SABC 过氧化物酶试剂盒(博士德生物，武汉)；DAB 显色试剂盒、EDTA 抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司)。1.2 方法1.2.1 BMSCs 的分离与冻存采用实验
9、室所用的“改良全骨髓培养法”获取细胞4 ，培养传至第 2 代；将 2.5106 mL-1 BMSCs 以 10%二甲基亚砜、10%新生牛血清、80% DMEM 为冻存培养液，按 4 0.5 h、-20 0.5 h 和 -80 冰箱过夜后放入液氮中，低温保存 12 个月。1.2.2 BMSCs 的复苏与培养冻存的 BMSCs 在 37 恒温水浴中迅速翻转解冻，离心、弃冻存液，收集细胞于标准环境中培养备用。以含 10%的新生牛血清的 DMEM 为基础培养液，以含 10%新生牛血清、10-8 mol/L 地塞5米松、50 mg/L 维生素 C 和 10 mmol/L 甘油磷酸钠的 DMEM为矿化诱导
10、培养液，复苏细胞在基础培养液和矿化诱导液中分别与支架在体外复合。1.2.3 BMSCs胶原膜的复合将 0.5 cm0.5 cm 的胶原膜在 24 孔板内分别加入基础培养液与诱导培养液预湿；取复苏的 BMSCs，以终浓度为 1107 L-1接种于已预湿的胶原膜上，每片接种 30 L，暂不加培养液，置 37 、体积分数为 0.05 的 CO2 孵箱中培养 0.5 h；然后分别加入基础培养液与诱导培养液 2 mL 继续培养，隔日换液，倒置显微镜下观察细胞附着情况。1.2.4 BMSCs胶原膜复合物的植入BMSCs胶原膜支架体外复合培养 5 d 后，将裸鼠用 100 mg/kg 氯胺酮麻醉后，于背部作
11、前后向约 0.6 cm 的切口，切开皮肤及皮下组织，在裸鼠皮下分别植入相应复合物。分组情况为：（1）矿化诱导组（15 只）：植入在矿化诱导培养液中复合的BMSCs胶原膜复合物；（2）未矿化诱导组（15 只）： 植入基础培养液中复合的 BMSCs胶原膜复合物；（3）对照组（12 只）：植入矿化诱导培养液中预湿的胶原膜支架。61.2.5 取材及组织学观察术后 4 周将各组动物引颈致死，取出植入物及周围组织，在4%的多聚甲醛中固定， 10%EDTA 脱钙液中脱钙，石蜡包埋，制成5 m 连续性切片，苏木精 伊红染色，光学显微镜下观察新生组织。1.2.6 免疫组织化学染色及测量按 SABC过氧化物酶试剂
12、盒说明书进行。切片脱脂至水洗，PBS 冲洗后置于 50 L 过氧化酶阻断溶液中室温下孵育 10 min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。抗原修复后先后滴加第一抗体和二抗，PBS 冲洗。滴加 SABC 试剂，28 孵育 20 min，加 DAB显色剂，在显微镜下观察，胶原显色为棕黄色。以 0.01 mol/L PBS代替第一抗体作阴性对照。利用 Imageproplus 6.0 图像分析软件对染色强弱进行光密度测定，每张切片随机选取 4 个高倍视野，与阴性对照做对比，测量每个标本的光密度值。1.3 统计学处理将光密度测量的数据行单因素方差分析（one way ANOVA） ，判断组间是否存在差别
13、；如存在差别时，采用 LSD 法进行 2 组之间7的比较。P非矿化诱导组(0.148 90.003 7)空白对照组(0.077 50.005 8)，组间比较差别有统计学意义（P0.05） 。3 讨论慢性牙周炎是一种慢性感染性疾病，可以导致牙周膜、牙槽骨等牙齿支持组织的丧失。干细胞移植是修复慢性牙周炎造成的牙周组织丧失的良好方法，BMSCs 具有来源方便，取材简单，对患者造成损伤小等优点，是目前最有希望在牙周再生医学中广泛使用的种子细胞。型胶原是骨组织中最主要的胶原，占骨组织有机成分的80%90%，构成了骨基质中的蛋白框架，它的合成与分泌是骨组织形成的前提条件；型胶原的有序排列是形成骨组织机械力
14、量的主要因素5 。本实验选择的 BMSCs 是一种多能干细胞，在植入9裸鼠体内可能分化为成纤维细胞、成骨细胞等，合成和分泌型胶原；通过对比 2 种培养液对 BMSCs 的体内生物学活性，发现矿化诱导培养液比非矿化诱导培养更有利于型胶原在裸鼠体内合成，这种促进型胶原合成的能力能否在牙周组织局部发挥作用尚需进一步通过动物实验得以证实。组织工程中支架的选择也会影响种子细胞的分化和再生能力。本实验选取牙周组织再生中常用的胶原膜作为支架，前期实验已证实 BMSCs 能够在 BME10X 胶原膜支架材料上良好附着和生长，BME10X 胶原膜支架可以应用于牙周组织中6 。本实验发现，细胞支架材料复合物移植到裸鼠体内 4 周后， BMSCs 以支架材料支架为基础，分泌大量的细胞外基质，形成新生的型胶原，而胶原膜支架大部分降解吸收，而单纯支架材料移植到裸鼠形成体内，支架材料很少分解，未见型胶原表达。实验中发现，胶原膜两侧支架的分解程度、细胞的
