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1、植物分子育种学的概念运用分子生物学技术的科学性与先进性，即可以将不同物种的遗传物质（DNA 或基因）导入受体细胞，再进行培育与选择，从而育出符合育种目标要求的新品种。植物分子育种可概括为三个层次上的工程技术：1将带有目的性状基因的供体总 DNA 片段导入欲改良的植物受体细胞，使其后代发生变异，从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型，培育出高产、优质、高抗的新品种；2分离目的基因，构建重组分子，导入需要改良的植物受体细胞，经过筛选，培育出获得目的性状，且综合性状优良的后代，育出新品种。3分子标记层次。 植物分子育种的特点1、打破物种分类的界限，充分利用自然界丰富的遗传资源，使遗传
2、物质能在不同的植物间，甚至在植物、动物和微生物之间进行交流；2、利用植株的特定细胞进行外源 DNA 或基因的转移，如卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞；或者幼胚、幼苗、芽丛分裂旺盛的细胞，它们随着整体生长发育的进程而完成外源 DNA 或基因的导入、整合与转化过程。无需经过细胞原生质体离体培养、转化诱导，形成再生株等一系列繁琐复杂的培养流程。3、适应面广，单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。4、与常规育种相比，育种时间明显缩短，一般只需 34 代各选系便可稳定。5、方法简便，室内外（大田、盆栽场、温室等）均可进行，常规育种工作者易于掌握。周光宇提出的“DNA 片段杂交”假说
3、：就整体分子而言，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的，容易相互排斥。但局部 DNA 分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性，因而远源 DNA 片段有可能进入受体细胞。在母体 DNA 复制过程中，这种 DNA 片段便与受体基因组相应区段整合，成为子代所表现的各种典型或非典型遗传变异现象的内在遗传依据。DNA 片段杂交假说的分子验证1、同工酶分析：在高粱稻（银坊亨加利）及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高粱相同而银坊（母本）没有的酶带，说明高粱稻中的这条酶带来自父本高粱；2、DNA 分子杂交：在对高粱稻基因组的分析研究中，取父本高粱 DNA 与母本水稻 DNA 进行分子杂交，除去两者的同源序
4、列，以其余的高粱 DNA 序列制备探针，与高粱稻 DNA 进行分子杂交，发现高粱稻 DNA 中存在高粱的同源序列，从而证实高粱稻基因组中确实存在高粱 DNA 片段，此即说明高粱 DNA 片段已整合于高粱稻的基因组中。3、DNA 复性动力学分析：在对高粱稻及其两亲本的重复序列 DNA 复性动力学分析研究中，发现高粱稻基因组的中度重复序列部分与母本水稻有差异，从而进一步说明这是由于父本高粱稻 DNA 整合于母本水稻基因组而造成的结果。外源 DNA 的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源 DNA 片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。外源 DNA 导入植物细胞三
5、个关键因素：一、有适宜的基因（包括目的基因、选择标记基因或报告基因）和合适的选择条件；二、组织培养体系，要求植物细胞必需有效的再生成株，频率高，周期短；三、外源基因导入到植物的途径和方法，要求损失小、频率高且外源基因能稳定的整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力。外源 DNA 导入方法：一、按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法。1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；2、化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙DNA 共沉淀、脂质体法等；3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。 二、按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接
6、导入法和种质系统介导法：1、载体介导法：将目 DNA 转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的 DNA 导入植物细胞中；2、直接导入法：以裸露的外源 DNA 通过化学或物理方法直接导入植物细胞；3、种质系统介导法：借助植物自身的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外源 DNA 导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。 一、农杆菌介导法又包括：（1）创伤植株感染法（又叫做整株感染） （2）原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞（3）叶盘法转化植物细胞。目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走：第一，将目的基因重组到适当的 Ti
7、 质粒载体或 Ri 质粒载体或其它类型的载体上。根据所选用的载体系统进行重组。重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌） 。1)直接转化法；2）三亲交配法。第三，目的基因进入植物细胞，即植物细胞的转化。根癌农杆菌获得了外源目的基因后，接下来的工作就是要转化给植物细胞。（原理）：农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约 200Kb） ，称为致癌质粒，简称 Ti 质粒。Ti 质粒上有一段 DNA 被称为转移 DNA（简称TDNA） ，能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体
8、细胞中表达。Ti 质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或 DNA 片段插入 Ti 质粒的 TDNA 中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。 （操作步骤）植物受体系统的建立；Ti 质粒转化载体系统的构建；工程农杆菌的制备；外源基因的转化；转化体的筛选和转基因植株的检测 二、基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将 DNA分子引入活细胞的转化技术。 （原理）利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源 DNA 的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组
9、织，从而达到将外源 DNA 分子导入细胞中的目的。 （操作步骤）1、受体细胞或组织的预处理。 通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）处理来调节受体细胞或组织的渗透压，维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。2、DNA 微弹的制备。这一过程是将外源基因 DNA 分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。3、受体材料的轰击。4、过渡培养与筛选培养。 轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般 12 周） ，以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因） ，再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，而转化细胞
10、则能继续生长分化，从而被筛选出来。 三、聚乙二醇法（原理）聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使 DNA 与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为 PEG 诱导法。 （操作程序）1、分离原生质体；2、提取带有目的基因的质粒或其它外源 DNA；3、取 0.5ml 新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为 2X106/ml）,加入 50l 小牛胸腺 DNA，混匀后静置 10 分钟，然后再加入 10ml 外源 DNA，轻轻混匀后静置 10 分钟；4、加入等体积 40的 PEG 溶
11、液，立即混匀，室温下置 30 分钟；5、每隔 5 分钟加 12ml 0.2mlCaCl2 溶液，逐步稀释到 10ml；6、离心收集原生质体，并重新悬浮培养到 10ml 培养基中培养 1 周；7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。 （基本特点）PEG 法的优点如下：1实验成本低，不需要特殊的仪器设备；2受体植物材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用此法；3得到的转化体中嵌合体很少；4结果稳定，重复性好；5有实验证明，此法可使两个非连锁基因的共转化率达 50左右；6有研究表明，用植物总 DNA 进行转化，其转化频率与用质粒 DNA 接近；7此法可与电击法、脂质体法、
12、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用，可大大提高转化率。PEG 法也有较大的局限性：1必须以原生质体为受体，而建立原生质体再生体系往往十分困难；2转化率仍然偏低。 四、浸渍法（基本原理）浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源 DNA溶液中，利用植物细胞自身的物质运输系统将外源 DNA 分子直接导入受体细胞。 现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源 DNA 吸入细胞内：1、外源 DNA 可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内；2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源 DNA 摄入细胞内；3、植物组织中的
13、传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细胞膜提供机会，尤其是生殖细胞以及分生细胞中，外源 DNA 进入细胞中的机会更大。 （基本方法）以种子为受体介绍其基本操作方法：1、将种子用 0.1的升汞或 2030次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮（也可剥去幼胚） ；2、将剥出的种子浸于无菌的 0.1 XSSC 缓冲液中，加入 20的二甲基亚砜（DMSO ） ；3、加入供体 DNA 溶液（100200g/ml） ，浸泡 30min 至数小时；4、用无菌 0.1 XSSC 缓冲液冲洗干净； 5、将种子放在无菌滤纸上吸干水份后，转入无激素的固体培养基上培养；6、将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选（用质粒
14、DNA 浸泡的种子） ，或成苗后转栽到土壤中进行变异性状分析（用总 DNA 浸泡的种子） 。 （基本特点）浸渍法具有如下优点：浸渍法是高等植物转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它无需昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，容易推广。 局限性如下：转化频率较低，重复性较差，筛选和检测也困难，往往很难得到分子生物学证据。 五、花粉管通道法（原理）在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因
15、此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。在花粉管伸入胚珠的过程中可形成花粉管通道，这为外源 DNA 分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源 DNA 能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间的染色体基因 DNA的结构愈不易亲和，而容易相互排斥 ，但从局部的 DNA 片段来看，两种来源的 DNA 在部分区段上可能保持一定的亲和性，因而远缘 DNA 片段在受体细胞 DNA 复制过程中有可能被重组进去，这便是染色体水平以下的分子杂交。（操作方法）1.柱头切除法：当受体植物自花授粉一定时间后（一般 23 小时） ，切
16、去花柱，然后马上在切口上滴入供体 DNA 溶液（浓度为 50100g/ml，溶于 1XSSC） ，最后套袋隔离至种子成熟 。2花粉粒吸入法：收集新鲜花粉加入到供体 DNA 溶液中混匀，使外源 DNA 吸入花粉粒，然后取混合液滴于预先去雄套袋隔离的雌花上进行人工授粉，再继续套袋至种子成熟。3柱头涂抹法：在未授粉前先用 DNA 溶液涂抹柱头，然后人工授粉套袋隔离，通过花粉管的伸入将外源 DNA 带入胚囊，成熟后收获种子。（基本特点）1 无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。避免了原生质体再生以及组织培养过程中可能导致染色体变异或优良农艺性状丧失的问题。2不受植物种属的限制，在具备有性生殖过程的任何植物上都能应用。3简便，易于掌握，可以在大田、棚栽或温室种进行。4育种时间短，筛选遗传稳定的品系一般只需 34 代时间。5通过外源总 DNA 片段的导入可以了解一些具有重大经济价值的农艺性状是否能够通过 DNA 片段进行转移，这些性状是单基因
