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1、1生存素在 5氟尿嘧啶诱导人绒癌细胞株 JAR 凋亡中的作用【摘要】 目的 探讨生存素(survivin)在化疗药物 5氟尿嘧啶(5Fu) 诱导的人绒癌细胞株(JAR)凋亡中的作用。方法 用 JAR 细胞株进行培养传代，以不同浓度 5Fu作用于 JAR 细胞，MTT 方法观察 5Fu对 JAR 细胞生长的抑制情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率，用逆转录聚合酶链(RTPCR) 和免疫印迹技术(Westernblot) 方法检测survivin 基因和蛋白的表达。结果 5Fu 对 JAR 细胞的生长具有抑制作用，并有浓度和时间的依赖性；5Fu 诱导 JAR 细胞凋亡，凋亡率随浓度而增加；5Fu 作用后
2、 survivin 基因和蛋白表达减少，随浓度增加而减少。结论 5Fu可能是通过降低 survivin 表达水平，诱导 JAR 细胞凋亡。 【关键词】 5Fu 人绒癌细胞 凋亡 survivinABSTRACT: Objective To study the role of survivin in choriocarcinoma cell JAR apoptosis induced by 5fluorouracil (5Fu). Methods The choriocarcinoma cell JAR strain was chosen in this study. The inhibitor
3、y effects of chemotherapeutical drug 5Fu on JAR strain were assayed with MTT method. Apoptosis was detected by AnnexinV/PI 2test. Expression of survivin was detected by reverse transcriptase PCR and Western blot. Results 5Fu inhibited the JAR cell growth in a doseand timedependent manner. 5Fu caused
4、 the apoptosis of JAR cell in a concentrationdependent manner. Survivin gene and protein decreased with the increase of 5Fu. Conclusion The decrease of the expression of survivin may play a critical role in JAR cell apoptosis induced by 5Fu.KEY WORDS: 5Fluorouracil (5Fu); choriocarcinoma cell JAR; a
5、poptosis; survivinSurvivin 是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)的新成员，在几乎所有常见肿瘤中都有过量表达13，且能明显抑制细胞凋亡的产生4，在绒癌的发生、发展中起重要作用。5 氟尿嘧啶(5Fluorouracil, 5Fu)是临床上最常见治疗绒癌的化疗药物，它可以抑制肿瘤细胞生长，但其是否影响肿瘤细胞凋亡及其凋亡机制的报道较少见。我们通过本实验观察了5Fu对 JAR 细胞株的体外抑制作用及诱导凋亡作用，同时检测了5Fu作用 JAR 细胞后胞浆中 survivin 的表达情况，探讨了survivin 在其诱导
6、凋亡的过程中可能的作用机制。31 材料与方法1.1 材料 人绒癌细胞株(JAR)购自中科院上海细胞库；DMEM 培养基、Trizol 购自 Gibco 公司；胎牛血清购自四季青生物公司；5Fu 购自美国 Sigma 公司；流式 Annexin V/PI 双染试剂盒购自深圳晶美生物制剂有限公司；PCR mix 和逆转录试剂盒购自 Fermantas MBI 公司；survivin 鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 JAR 细胞株用含有 10%(体积分数)胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，在 37 、5%( 体积分数 )CO2 中培养
7、。细胞贴壁生长，胰酶和 EDTA 消化传代。1.2.2 噻唑蓝比色分析实验 5Fu组为 25、50 、100g/L共三个不同剂量组，用培养液稀释，JAR 细胞消化成单细胞悬液，用含 10%(体积分数) 胎牛血清的 DMEM 培养基调整细胞浓度为108/L，取上述细胞液 100L置 96 孔培养板中预培养 24h。每组设 6 个复孔(实验重复 6 次) ，接种后 24h 更换培养液。实验组加入不同浓度药物的培养液，阴性对照不加药，空白对照只加培养液，加药后于 24、48、72h 加入 5mg/L 的 20L MTT，同样条件下继4续培养 4h 后倒出培养液，加入 150L二甲基亚砜(DMSO)振
8、荡溶解 10min，空白对照调零，酶联仪检测波长为 490nm 时各孔的吸光值(A 值)，计算抑制率。抑制率=(阴性对照 A490 值-实验组A490 值)/阴性对照 A490 值100%。1.2.3 应用双标记流式细胞术定量分析凋亡情况 按照常规消化收集细胞(每个浓度三瓶) ，以冰 PBS 洗两遍后，用试剂盒提供的结合缓冲液 250L重悬细胞，调整细胞浓度约为 106/L，取 100L细胞悬液，各加入 5L Annexin VFITC和 10L PI，混匀，将试管避光放置 15min，反应管中加 400L PBS，立即上流式细胞仪检测。结果判定：FITC-/PI-为活细胞，FITC+/PI-
9、 为凋亡细胞，FITC+/PI+为坏死细胞。1.2.4 逆转录聚合酶链反应检测 survivin 基因的表达 按照常规步骤消化并收集细胞，使细胞数达 106-107/L，1000r/min 离心10min，PBS 洗 2 遍后，吸干 PBS，加入 1mLTrizol 溶液裂解。按Trizol 试剂说明提取细胞内的总 RNA。按照逆转录试剂盒说明将总RNA 转录成 cDNA。之后按 PCR mix 试剂盒说明进行 PCR 扩增(PCR 扩增仪为北京六一仪器厂制造)。RTPCR 扩增 survivin 引物为 5CCCTGGCTCCTCTACTGT3(正义 )，5CAAATCCATCATCTTAC
10、GC3(反义)，扩增片段大小为466bp。actin 引物为 5GTGGACATCCGCAAAGAC3(正义)，55AAAGGGTGTAACGCAACTAA3(反义 )，扩增片段大小为302bp。反应条件：94变性 1min，49.4退火 45s，72 延伸45s，35 个循环，最后 72延伸 7min，扩增产物经 2%(体积分数)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。BandScan 分析软件分析。1.2.5 免疫印迹检测 survivin 蛋白的表达 蛋白质提取：冰PBS 洗细胞 3 次，吸净 PBS，加入 Triple 裂解缓冲液 200L，将裂解物转移至离心管，混匀后离心，将上清液吸出，留待蛋白
11、定量和实验。SDSPAGE 电泳和免疫印迹：采用 Bradford 法测定蛋白质浓度，以 30g/孔上样，在 15%(体积分数)的 SDSPAGE凝胶中进行电泳分离，电转移法 25V 12h 将蛋白从 SDSPAGE凝胶转移至醋酸纤维素膜，在含 0.5g/L 脱脂奶粉的 TBST 中 37封闭 1h，加入一抗(鼠抗人 survivin 单克隆抗体，稀释度为 1100)，4孵育过夜，TBST 充分漂洗 (3min6 次)，加入二抗 (辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG，稀释度为 12000)，37作用 1h，TBST 充分漂洗(3min6 次)，DAB 显色，观察结果。数据分析采用凝胶成像系统。
12、1.2.6 统计学处理 实验数据应用 SPSS 13.0 for windows 统计软件进行处理，采取重复测量设计资料的方差分析，P0.05 为差异有统计学意义。62 结果2.1 5Fu对细胞生长的抑制作用 随浓度增加及作用时间延长，5Fu 对 JAR 细胞生长的抑制作用增强。由此可见，5Fu 对JAR 细胞具有明显的抑制作用。相同条件下，24、48 及 72h 均可观察到抑制率随药物浓度增加而提高(P0.05)，并且相同药物浓度时，作用时间越长，抑制率越高(P0.05，表 1)。表 1 不同浓度 5Fu在不同时间作用点对 JAR 细胞生长抑制率的影响（略）Table 1 Effect of
13、 various concentrations of 5Fu on inhibition rate of JAR at different time points*P0.05 vs. 24h group, #P0.05 vs. 48h group2.2 5Fu对细胞凋亡的影响 作用 24h 后观察结果显示，5Fu诱导的细胞凋亡率与其浓度呈正相关，即凋亡率随着浓度增加而提高，25、50、100g/L 的 5Fu作用后凋亡率分别为(13.861.36)%，(23.162.49)%，(57.375.10)%，各药物组与细胞对照组间有显著性差异(P0.05)，各组间比较也均有显著性差异(P0.05，表
14、 2)。72.3 不同浓度的 5Fu作用后 survivin mRNA 的表达 Survivin mRNA 在 JAR 细胞中存在表达。RTPCR 结果显示 5Fu诱导 JAR 细胞凋亡时，survivin mRNA 的表达受抑制而减少，作用24h 观察，其表达随着浓度增加而减少。 Survivin mRNA/actin：25、50、100g/L 的 5Fu作用后分别为0.4360.049，0.4280.044，0.2970.022，各药物组与细胞对照组比较均有显著性差异(P0.05)，25g/L 与 50g/L组间比较差异不显著(P=1.0)，其余各药物组间比较均有显著性差异(P0.05，表
15、 2、图 1)。表 2 不同浓度 5Fu作用 24h 后 survivin mRNA/actin, survivin/GAPDH 以及 apoptosis rate 值的比较（略）Table 2 The comparison of survivin mRNA/actin, survivin/ GAPDH and apoptosis rate after 24h with different concentrations of 5Fu*P0.05 vs. 0 group,#P0.05 vs. 25g/L group, P0.05 vs. 50g/L图 1 不同浓度的 5Fu作用 24h 后 su
16、rvivin mRNA 的表达（略）8Fig.1 The expression of survivin mRNA after 24h with different concentrations of 5Fu2.4 不同浓度的 5Fu作用后 survivin 蛋白的表达Survivin 蛋白表达于 JAR 细胞中，且其表达受到 5Fu的抑制，24h 后观察到其表达随药物浓度增加而减少。25、50、100g/L 的 5Fu作用后其 survivn/GAPDH 值分别为：0.4520.154，0.3920.069，0.0930.007，各药物组与细胞对照组比较均有显著性差异(P0.05)， 25g/L与 50g/L组间比较差异不
