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1、1灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体诱变育种实验研究【摘要】 目的： 建立采用紫外线和氯化锂诱导灭蚊真菌发生突变的方法，为培育理想菌株开辟新的途径。方法: 对出发菌株贵阳腐霉的原生质体进行诱变处理，通过正突变率与紫外、化学诱变剂量的相互关系，确定最佳诱变条件，经过酪蛋白平板透明圈和菌粉得率粗筛突变株，连续 8 代传代培养及摇瓶实验检测突变株的遗传稳定性。结果: 当用 0.6%氯化锂处理 90 min 时，突变株的致死率和正突变率分别为 86.9%和 26.9%；用 20 W 紫外灯 30 cm 照射 180 s，突变株致死率为 81.3% 、正突变率为 78.5%；筛选了 7株突变株，其中 U22 经传
2、代实验证明其遗传性状稳定。结论: 本研究所建立的对贵阳腐霉原生质体诱变系统基本成功，为该菌的细胞工程育种创造了条件。 【关键词】 贵阳腐霉; 原生质体; 紫外线； 氯化锂; 诱变； 育种Abstract Objective: To establish a mutation induction system for mutation breeding of Pythium guiyangense Su, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: Protoplasts of original strain were treated with UV or
3、LiCl for mutation induction. Casein plate transparent loop method 2and mycelial weight determine were used to screen mutant colonies. Pertinent induction condition combination were summarized based on the analysis of the relationship between the positive mutation rates and treatment dosages and peri
4、ods of UV or LiCl. One of the mutational colonies was continuously cultivated for 8 generations on KPYG2 plates for the observation of genetic stability. Results: A lethal rate of 86.9% and a positive mutation rate of 26.9% were achieved when the protoplasts were treated by 0.6% of LiCl for 90mins,
5、and a lethal rate of 81.3% and a positive mutation rate of 78.5% were obtained when the protoplasts were irradiated by a UV lamp of 20W in a distance of 30cm for 180s. Seven mutants were obtained, and one of them, U22, was proved genetically stable. Conclusions: The mutation induction system of P. g
6、uiyangense by UV and LiCl is successful, and can provide basis for the mutation breeding of P. guiyangense in the future.Key words Pythium guiyangense Su; protoplasts; ultraviolet rays; lithium chloride; mutation breeding丝状真菌贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）具有灭蚊3能力强，繁殖速度快，易于人工培养以及对其它非靶生物相对安全等优点1，在蚊虫生物防治中
7、具有潜在的应用前景。 但是，与大多数微生物一样，贵阳腐霉在人工培养基经过多次传代后其毒力和产孢量会有所下降；同时，与大多数丝状真菌一样，其有效贮藏期不够长。为将贵阳腐霉真正用于灭蚊，提高其灭蚊能力和延长有效贮藏期，对贵阳腐霉进行了改良。微生物改良育种方法较多，原生质体诱变技术是一种行之有效的方法2，3。杜海英4等通过原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株。目前有关利用原生质体紫外诱变和氯化锂诱变提高丝状真菌遗传稳定性方法报道较少。贵阳腐霉是发现的新种，其诱变研究尚未见报道。2008 年 1 月8 月对贵阳腐霉原生质体进行紫外诱变和（或）氯化锂诱变，为该真菌的细胞工程改良奠定基础。1 材料与方法1.1
8、实验材料1.1.1 菌种来源于贵阳医学院蚊虫生物防治实验室。菌丝在固体培养基上每 7 天转种 1 次，培养温度为（ 251）。1.1.2 培养基4菌丝培养液（KPYG2）：葡萄糖 1.5 g/L，酵母 1.0 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，氯化钙 0.075 g/L，胆固醇 0.02 g/L，玉米油 10 g/L。菌丝固体培养基：KPYG2 加入琼脂粉 10 g/L。酪蛋白水解培养基：NaHPO47H2O 1.07g/L，KH2PO4 0.36 g/L，酪蛋白 4 g/L，琼脂粉 20 g/L。再生培养基：用 0.6 mol/L 进口蔗糖渗透压稳定剂溶解 KPYG2 各成分。氯化锂的诱变培养
9、基为 LiCl(0.2%1%)加再生培养基。1.1.3 酶液配制配制浓度为 0.6 mol/L 的进口蔗糖作为渗透压。取 1 g 酶用渗透压稳定剂溶解成质量分数为 1%的酶液，经 0.22 m 微孔滤膜过滤除菌后使用。1.2 诱变方法1.2.1 贵阳腐霉原生质体的制备与再生参考文献5制备足够量（6.48106 个/ml）的原生质体，经系列稀释后取 0.1 ml 于再生培养基平板，同时将原生质体悬液用无菌水稀释，普通培养基平板作为对照。 （251）培养 5 d 后计算其再生率。51.2.2 原生质体诱变处理1.2.2.1 紫外线（UV）诱变取 5 ml (1.0106 个/ml) 贵阳腐霉原生质
10、体均匀涂于再生培养基中，在磁力搅拌作用下距 20 W 紫外灯 30 cm 处分别照射 30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s，对每个处理进行系列稀释；再各取 0.1 ml 涂布于再生培养基平板，用黑纸包好后置于温室避光培养 5 d。以上操作均在红光下进行。根据形成的菌落数计算原生质体致死率和正变率。致死率=（1-再生的菌落数/原生质体总数再生率）100%，正突变率=（透明圈比出发菌株大的菌落总数/所有被测菌落总数）100% 。以诱变时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制紫外线对原生质体的致死曲线。1.2.2.2 LiCl 诱变处理将获得的贵阳腐霉原生质体浓度控制
11、在约 106107 个/ml ，加入 LiCl 溶液，形成 LiCl 终浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 的 1 ml 反应体系，置（251）温箱中避光反应 45 d，然后置于（251）恒温摇床分别振荡30、60、90、120、150 min，迅速低温离心（ 6 000 r/min,4 ,5 min） ，取上清液，加硫代硫酸钠中止反应,用生理盐水洗涤 2 次、6离心、收集上清液6，用渗透压稳定剂稀释后涂布平板。对照组的菌液以同样方法进行。计算致死率、正突变率，选择最佳 LiCl 浓度及诱变时间。1.3 突变株筛选方法1.3.1 菌丝得率切取 1 cm3 含诱变菌株的琼
12、脂块至菌丝培养液（KPYG2 ）中，摇床培养 5 d，过滤得湿菌丝体，滤干，以 100 ml 培养基中得菌丝湿重计算得率。1.3.2 突变体粗筛将诱变所得的菌株分别接种于含酪蛋白的培养基上，观察酪蛋白水解圈（HC） 。每个平板接种一块出发株作为对照， （251）培养，测量 HC 值7（HC=水解圈直径/菌落直径） 。见图 1。1.4 遗传稳定性观察将获得的 26 株突变株每株接种两个斜面和 2 个三角瓶传代培养，并对其中生长力特别旺盛的 7 株进行跟踪观察，筛选出的菌7丝得率最高的 U22 连续 8 次继代培养，观察其每代菌丝得率的变化。2 结果2.1 紫外线照射的诱变效果原生质体致死率与紫外
13、线照射时间有关。照射时间越长，存活的原生质体越少，即致死率越高（图2） 。原生质体经 UV 处理诱变后形成的再生菌落在菌落直径和形态方面与对照组都有较大差异。以菌落直径大、生长速度快作为标准，共筛选 26 个诱变株保存。紫外线照射后贵阳腐霉原生质体致死率和正突变率见图 3。A.无紫外照射；B.紫外照射 60 s；C.紫外照射180 s；D.紫外照射 210 s。2.2 LiCl 诱变与致死率和正突变率的关系分别固定处理时间（90min）测最佳 LiCl 浓度（图 4） ，固定 LiCl 浓度（0.6%）测试最佳作用时间（图 5） 。2.3 贵阳腐霉诱变株的遗传稳定性7 株菌的菌丝得率都很稳定，
14、U2 为 0.53%，U6 为0.68%，U7 为 0.23%，U14 为 0.98%，U15 为 0.32%，U21 为81.06%，U22 为 1.25%，原菌株 0.8%，特别是 U22 菌丝得率最高的。 U22 连续 8 次继代培养，各代的菌丝得率基本上都超过原始菌株（表 1） 。表 1 突变株 U22 连续 8 代继代培养菌丝得率比较（略）3 讨论丝状真菌菌丝有细胞壁，不宜作诱变材料。去除细胞壁的原生质体对外界环境比较敏感，经诱变剂处理后容易发生突变。原生质体诱变技术一般能保持原有菌种的主要生物学性状特点，育种周期短，突变株生物学性状比较稳定，不易退化。因此，原生质体诱变育种方法已成
15、为当前丝状真菌育种的一种重要方法8。在物理和化学诱变研究中，致死率和正突变率的范围选择是关键。一般认为，致死率以 9099.9%效果较好，致死率高说明诱变的作用比较强。但也有报道认为，较低的致死率有利于正突变菌株的产生，以70%80%或更低的致死率为好9。贵阳腐霉原生质体，菌丝体在（251）培养 5254 h 后，用 1%纤维素酶与 1%溶壁酶、加上1%蜗牛酶消化 5 h 可获足够量（6.48106 个/ml ）的原生质体,但是再生率比较低（0.043% ）5 。 本研究中，经过改良再生培养基后再生率提高为 0.54%，此再生率基本上能满足原生质体诱变育种的需要，为开发以贵阳腐霉原生质体为媒介
16、的生物技术提供了一个良好的再生系统。9本试验中发现，紫外照射时间越长，致死率越高；当照射时间大于 210 s 时，致死率高于 91.5%（图 3） ，表明贵阳腐霉原生质体对紫外线的敏感性较低。经反复试验的结果，贵阳腐霉原生质体在 20 W 紫外灯 30 cm 处照射 180s 诱变效果最好，该条件下致死率为 81.3%时，正突变率为 78.5%。HC 值是反映菌株产酶能力的指标。一般来说，高 HC 值的突变株优于低 HC 值的突变株。虽然 LiCl 导致的总体正突变率（图4 和图 5）低于与紫外线诱导引起的总体正突变率（图 3） ，但 LiCl正突变株 HC 值总体较紫外诱变株 HC 高，仍然说明 LiCl 具有较好的诱变效果。在 0.6%LiCl 作用 90 min 条件下进行两次试验，致死率分别为 86.9%、87.1%，正突变率分别为 26.9%、27.6%，为最高正突变率，方便筛选。因
