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1、1溶血性链球菌制剂 OK432 联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞的成熟【摘要】 目的 探讨溶血性链球菌制剂（OK432 ）联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞（DCs）成熟的作用,改进体外诱导DCs 成熟的方案, 为后期制备临床使用的抗肿瘤 DCs 疫苗提供新的技术路线。 方法 分离小鼠骨髓单核细胞（BMMCs）,并在含 10%胎牛血清(FCS)、重组小鼠粒 巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF) 、重组小鼠白细胞介素4(rmIL4) 的培养体系中诱导培养 ,部分加入OK432 和/或肿瘤冻融抗原冲击,光镜和透射电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞表面分子 CD83 和 CD86
2、的表达情况。 结果 经OK432 联合肿瘤细胞冻融抗原冲击的 DCs 形态学特征典型。肿瘤冻融抗原冲击后,DCs 表面 CD83 和 CD86 的表达上调,OK432 进一步刺激后,CD83 和 CD86 的表达率显著升高。 结论 采用 OK432联合肿瘤冻融抗原诱导 DCs 成熟的方案相对简便；OK432 能有效促进肿瘤冻融抗原冲击后的骨髓 DCs 进一步成熟。 【关键词】 树突细胞 溶血性链球菌制剂 骨髓 抗原 肿瘤树突状细胞（dendritic cells,DCs）是目前所知体内功能最强的抗原呈递细胞,具有打破肿瘤免疫耐受并激发特异性肿瘤免疫而抑制肿瘤发展的能力。随着 DCs 体外培养扩
3、增技术的日益成熟,DCs2肿瘤疫苗作为肿瘤治疗的新方法,显示了良好的抗肿瘤前景1。但要使 DCs 肿瘤疫苗真正广泛应用于临床, 其体外培养扩增技术还需进一步优化。本实验采用链球菌制剂OK432 联合肿瘤细胞冻融抗原诱导小鼠髓源性 DCs 成熟, 并从形态学、细胞表型方面对其进行鉴定,为进一步研究该 DCs 疫苗的体内外抗瘤活性提供试验基础,改进体外诱导 DCs 成熟的方案 ,为后期制备临床使用的抗肿瘤 DCs 疫苗提供新的技术路线。1 材料与方法1.1 主要材料 小鼠前胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞( 中国科学院细胞库） ；PRMI 1640 干粉培
4、养基（美国 GIBICO 公司） ；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司） ；重组小鼠白细胞介素4 （rmIL4, 美国 R&D 公司） ；重组小鼠粒 巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF, 美国 R&D公司） ；PE 标记的大鼠抗小鼠 CD86、CD83 及 PE 标记的同型IgG1（美国 Biolegend 公司） ；OK432（山东鲁抗制药公司） ；红细胞裂解液(139.6 mmol/LNH4Cl,16.96 mmolL Tris,用 1 molL HCl 调 pH 至 72,本室配制) 。1.2 实验动物 雄性 SPF 级 615 小鼠,68 周龄,体质量1520 g大连医科大学实
5、验动物中心,许可证号：SCXK(辽)320040017。1.3 方法1.3.1 制备小鼠前胃癌细胞冻融抗原 常规培养 MFC 细胞,制成 1107 mL-1 的细胞悬液,8037 反复冻融 4 次, 离心收集上清液, 过滤 , 20 保存备用 12。1.3.2 获取骨髓前体细胞 取 615 小鼠颈椎脱臼处死, 无菌取双侧股骨和胫骨。去除附着的肌肉和结缔组织,剪掉骨两端,用 PBS液冲洗骨髓腔,制成骨髓细胞悬液,400 目尼龙网过滤,离心弃上清,110 的体积比加入 37 预温的红细胞裂解液,反复吹打混匀,室温5 min,PBS 离心洗涤 2 次,用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全
6、培液调整细胞浓度为 5106 mL-1,接种于 6 孔培板,培养孵育 2 h,吸去悬浮细胞,所得的半贴壁细胞即骨髓单核细胞（bone marrow mononuclear cells ,BMMCs)24。1.3.3 体外诱导分化骨髓 DCs 将贴壁的 BMMCs 分为 3 组,置于含 10%FCS、GMCSF （1 000 IU/mL） 、IL4 （500 IU/mL）的 PRMI 1640 完全培养液中,37 、体积分数为 0.05 的CO2 条件下继续培养 ,分别于第 3,5 天各全量换液 1 次并补加细胞因子, 并将其中 2 组于培养第 4 天加入 MFC 细胞冻融抗原冲击使4BMDCs
7、 捕获并处理抗原（按制备冻融抗原前的肿瘤细胞数量与DCs 数量 31 的比例加入肿瘤抗原）16 h 后换液,并给其中 1 组加入 OK432 5 g/mL,继续培养 48 h,于培养第 7 天分别收集 3 组悬浮细胞2：BMDCs 组（GMCSF 、IL4 诱导但未经抗原冲击的DCs） ；TLDCs 组（经 GMCSF、IL4 诱导及肿瘤冻融抗原冲击的 DCs） ； OKDCs 组（经 GMCSF、IL4 诱导诱导及肿瘤抗原冲击后加入 OK432 进一步促进其成熟的 DCs） 。1.3.4 细胞形态观察 每日用倒置显微镜直接观察细胞形态并拍摄照片。培养 7 d 后,收集各组 DCs,3%戊二醛
8、1.5% 多聚甲醛前固定,1%锇酸1.5% 亚铁氰化钾后固定 ,酒精 丙酮脱水,环氧树脂618 包埋剂包埋；超薄切片,醋酸铀、柠檬酸铅染色,透射电镜观察、摄影。1.3.5 细胞表型检测 分别收集诱导前的 BMMCs 和培养第 7天 3 组细胞,PBS 缓冲液洗涤 ,调整细胞浓度 2106mL-1,每组细胞分成 3 份, 分别加入直接荧光标记抗体 PECD83、PECD86 及同型阴性照。4 避光孵育 45 min,PBS 洗涤 ,重新悬浮细胞, 流式细胞仪分析 104 个细胞分布及抗原表达情况。1.4 统计学处理 数据以 xs 表示。采用 SPSS 11.5 软件包处理数据。单因素方差分析,S
9、NKq 检验对数据进行两两比较,5P 0.05 为差别有统计学意义。2 结果2.1 DCs 形态2.1.1 光镜观察 BMMCs 培养第 1 天,倒置显微镜下可见大量的细胞聚集成均匀散布的细胞集落,呈簇状生长,形如葡萄串,细胞体积小, 多为圆形, 细胞无突起（图 1A） ；第 4 天, 细胞从集落中逐渐释放出来,半贴壁状散在分布, 体积逐渐增大,形状不规则, 呈蝌蚪状或梭形, 有少量毛刺状突起, 即为未成熟 DCs（图 1B） ；加入肿瘤冻融抗原冲击 16 h 后再给予 OK432 诱导 48 h 后即培养第 7 天,细胞集落消失, 多数细胞悬浮, 体积明显增大 ,细胞质丰富, 表面有粗大树突
10、状突起,即为成熟 DCs（图 1C） 。背景可见少量长梭形细胞 ,为伸展的巨噬细胞。DCs：树突状细胞. A: 诱导培养第 2 天的 DCs（200） ； B:诱导培养第 4 天的 DCs（200 ） ；C:诱导培养第 7 天的DCs（ 400）图 1 光镜下小鼠骨髓树突状细胞体外培养形态学变化（略）6Fig 1 The development of dendritic cells from mouse bone marrow in vitro under optical microscope2.1.2 电镜观察 培养至第 7 天的未经肿瘤冻融抗原冲击的DCs, 细胞圆,形态较规则,表面突起少
11、而短,呈丘状或粗短指状,细胞器不发达,呈未成熟 DCs 形态；经肿瘤冻融抗原冲击后的 DCs,形态不规则, 表面突起逐渐增多、增长, 细胞核不规则,呈偏位；经 OK432 联合肿瘤冻融抗原诱导的 DCs 表面有大量皱褶和细长的分支样突起,细胞质含有丰富的线粒体和少量溶酶体,可见粗面和滑面内质网及高尔基体, 细胞核大不规则, 呈偏位（图 2） 。2.2 细胞表型 贴壁的 BMMCs 在不同条件下诱导 7 d,均可诱导出 DCs,各组 DCs 细胞表面表达的 CD83 和 CD86 均上调,与BMMCs 组相比有统计学意义（P0.01） ；肿瘤冻融抗原冲击后,DCs 表面 CD83 和 CD86
12、的表达显著增加（ P0.01） ；用 OK432进一步刺激后,CD83 和 CD86 表达率显著升高（P0.05,图 3,表 1） 。3 讨论目前, 分离 DCs 的方法主要有两种:一种为免疫分选法,该法分离纯度高,但费用昂贵, 操作复杂,并且如果抗体选择不当, 很容易丢失DCs,还会影响一些重要因子的分泌,进而改变 DCs 的功能56 。另7一种为培养粘附法,该法根据早期未成熟 DCs 具有轻度粘附生长的特点, 在培养初期通过手法筛选去除悬浮的细胞（如粒细胞、淋巴细胞）,同时巨噬细胞是紧密贴壁生长, 因此收集半粘附的细胞即为 DCs 前体, 也能够得到大量纯度高的 DCs。该方法具有费用低廉
13、、操作简单、适合临床使用等优势6。本实验采用培养粘附法，于培养早期吸弃悬浮的淋巴细胞、粒细胞等，所得的半贴壁的 DCs 前体经重组小鼠GMCSF、重组小鼠 IL4、肿瘤冻融抗原及 OK432 诱导、扩增，至培养第 7 天，从每只小鼠骨髓中可获得约（2 3）106 个树突状细胞，可满足进一步实验需要。 A: BMDCs (8000); B: TLDCs (8000); C: OKDCs(4000); BMDCs：诱导分化的骨髓树突状细胞；TLDCs：经肿瘤冻融抗原冲击的树突状细胞；OKDCs ：OK432联合肿瘤冻融抗原冲击的成熟树突状细胞.图 2 诱导培养第 7 天各组 DCs 的电镜下形态（
14、略）Fig 2 The appearance of dendritic cells after 7d of culture under electron microscopeBMMCs：贴壁分离的骨髓单核细胞；BMDCs ：诱导分化的骨髓树突状细胞；TLDCs ：经肿瘤冻融抗原冲击的树突状细胞；8OKDCs：OK432 联合肿瘤冻融抗原冲击的成熟树突状细胞 . 各组均采用阴性对照(未显示).图 2 诱导前的 BMMCs 和培养第 7 天各组 DCs 表型流式图（略）Fig 2 The phenotype of bone marrow mononuclear cells and dendriti
15、c cells after 7d of culture表 1 诱导前的 BMMCs 和培养第 7 天各组 DCs 表面分子表达率的比较（略）Tab 1 The expression of surface molecules on bone marrow mononuclear cells and dedndritic cells after 7d of culturen=3. BMMCs：贴壁分离的骨髓单核细胞； BMDCs：诱导分化的骨髓树突状细胞；TLDCs ：经肿瘤冻融抗原冲击的树突状细胞；OKDCs ：OK432 联合肿瘤冻融抗原冲击的成熟树突状细胞 . 与 BMDCs 组比较,:P0
16、.01; 与 TLDCs 组比较,:P0.05; :P0.01.9肿瘤抗原的选择是 DCs 疫苗制备的重要环节。肿瘤抗原主要有 2 类：肿瘤特异性或相关性抗原和全细胞抗原。肿瘤特异性或相关性抗原其抗原表位明确,具有很好的靶向性。但大多数肿瘤的特异性或相关性抗原仍未得到明确鉴定,且肿瘤突变使得针对单一抗原的免疫治疗不能发挥作用,因而限制其临床应用。全细胞性肿瘤抗原包括所有已知和未知的抗原,经过未成熟 DCs 的摄取、加工和呈递后,可激发针对多种肿瘤抗原簇的 CTL 克隆, 减少了对单一抗原表位发生免疫逃逸的可能,保证了肿瘤免疫的全面有效性；且全细胞抗原易获取和制备,有较大的临床应用潜力。因此在该研究中,笔者选择简便易行的反复冻融法从全细胞中提取可溶性抗原负载 DCs。肿瘤细胞冻融物中包
