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1、中国医科大学硕士学位论文BAMBI在非小细胞肺癌中的表达姓名：苗参申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：崔泽实20070401中豳医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明爨莹交媳学位论文是我本人农譬黪指导下进褥鲍磺兖薹髂及联褥的研究成果。据我所知，除了文申特别加泼标浚和致谢的地方黔，论文审不包含箕链入已经发袭或撰霉避翡研究成苯，也不包含为获褥我蛟袋其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工律的阍志对本研究所做的任何贡靛均范在论文中律了明确昀谎绢并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切栩关责任论文作者签名：蓬!薹 日期：芷122：兰：f?中国医科大拳研究生学位
2、论文版权使用授权书本入完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位濑瓣论文T-作的知识产权单位属串霹医科太学。本入保证肇韭离校后，发袭论文或使用论文工作成果时署名单位为中图医科大学，且导师药通识终孝，遥讯儋孝单位赛署名黄中国医辩犬学。学校翥权豫塞菇囊墓容煮关部魍或规拽遴交论文缝复印件=譬掰磁盘，允许论文被查阕和借阕。学校胃淡公布学位论寒的垒帮或部分悫睿(缳密爵容除外)，蔽采蔗影帮、缩玲或其毽筝段保存论文论文律耆签霭： 篮指导教师签名：乏燧嚣 期：望兰耄；苎：1 2中文论著摘要BAMBI在非小细胞肺癌中的表达韵 翥肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也怒全球恶性肿瘤致死的首要因素
3、。据报道，目前我国肺癌发病率每年增长269。因此，加强以肺癌分子生物学等领域为基础的肺癌病因学研究，从而探讨其发瘸机理及治疗方法舆肖极其重要的意义。BAMBI(B黼P and aefivin membrane-bound inhibitor)基因定位在lO号染色体p123-p112区域，编码产物为一个flq260个氨熬黢组成的跨膜糖蛋白，分子量29108道尔顿，又称作伪受体(pseudoreeeptor)、NMA(non-metastatic geneAprotein)，属予BAMBI家族。该家族成员与转证生长因子一(the transforming growth factor-13，TGF一
4、转)，骨形态发生鬣巍(bone morphogenetie protein，BMP)、激活素(a醴ivin)等配体的I型受体胞外区都具有相似的结构。因此BAMBI能够整含剿配体受体复合物中，并与TGF311型受体形成聚合物，但由于它不具有TGF-13 I型受体所特有的丝氮酸，苏氨酸激酶结构域，所以不能磷酸化胞浆内的Smad蛋岛，从丽在受体水平上辍滞TGF德号转雾。蠢礤究表臻，霹予耱瘗等上疫缝缓来源豹耱瘗恧言，TGF-I$可以抑制肿瘤细胞的增殖，而BAMBl在TGF一8信号通路中的负调节机制对肺癌的作用目前尚不清楚。另外，据报道BAMBI在人结肠癌、肝癌中均存在表达上调，假在非小细胞肺癌中的表达
5、尚未明确。嚣 鲮检测BAMBI在非小细脆肺癌(non-smaU cell lung cuneffl，NSCLC)组织中的表达情况，探讨其与NSCLC临床病理因素之间的关系；同时观察BAIVlBI在非小细胞肺癌细胞系中的表达分稚情况，并探讨其袭达与NSCLC病理分测及侵袭潜能之闻的美系。实验材料与方法一、非小细胞肺癌组织及细胞系63例NSCLC及癌努芷常组织标本用于免疫组织化学检测。其中31例新鲜肺癌组织及灏旁正常爨续绞标本，禾嚣囊帮投入液鬣速冻之磊，于，70。C徐存，瘸子RTPCR梭测。三株NSCLC细胞系包括人肺腺癌细胞系A549、人肺巨细胞编高侵袭潜能的驻系BEl以及人肺巨细胞癫低侵袭潜能
6、的亚系LH7耀予免疫荧光技术、RT-PCR汉及Western blotj盘攘ilj。二、半定量RTPCR用RNAout提取总RNA，合成BAMBI、G燃珏弓|镌，应用两步法RT-PCR试剂盒合成eDNA链，然厢送行PCR扩增。产物经2琼脂糖凝胶电泳，用自动电泳凝胶成像分析系统采集图像，测定条带积分光密度值。三、免疫维织化攀染色组织经多聚甲醛阐定，制成石蜡切片进行免疫组化sP法染色，一抗l：200稀释，DAB照色，苏木精复染，中性树胶封片。用照微镜观察采集图像。露、纲耱培养A549细胞培养于禽10胎牛m清的DMEM培养基；BEl殿LH7细胞培养于含10胎牛斑清的RPMll640培养基。所有细胞都
7、农37。C、5C02条件下孵霄。五、Western blotJ朔J离心收集细胞，加入适量裂解液，离心取上清。蛋白定量后电泳、转膜，封ll后热入挠(1：1000)4。C过夜。次尽搬入二抗(I：10000)常温2h，加入ECL试剂暗室曝光，雳自动龟泳凝胶残像分析系统采鬃图像，测定絷带积分光密凄值。六、免疫细胞荧光染色绥爨惩片，曩多聚擎醛霆定，辩瓣磊热入一藏(1：200)4。0过夜，次翻翔入FITC标记的二抗(1：100)室温2h，PI(1：1000)核复染，封片。应用激光共聚焦扫描显微镜系统观察采集图像。2结果BAMBImRNA在癌旁组织中有较弱的表达，其在癌组织中的表达高于相应的癌旁组织(035
8、8：L0135vs0249a：0129)，两者差异具有显著性意义(P-0003)。BAMBI蛋白主要表达在胞膜和靠近胞膜的胞浆，其在癌组织中的表达高于癌旁组织，两者差异具有显著性意义(P。BAMBI protein expressed mainly in themembrane and the cytoplasm close to the membrane，its expression in the CanCer tissuewas higher than that in the adjacent tissues，the difference Was significant(P75为4分；再按
9、染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后按照两项乘积分数划定4个等级：“一”(02分)，+”(34分)，“+”(689)，十卜+”(912分)。即分数3定为阳性，3为阴性。(2)数据统计所有数据均经SPSS 120软件进行统计分析。计数资料采用刀检验分析；计量资料采用均数4-标准差(is)表示；癌组织与正常组织的差异用配对t检验；两组均数的比较用t检验；两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)；显著差异设为95。实验结果一、组织经RTPCR检测结果BAMBI mRNA在NSCLC癌组织及癌旁组织中均有表达，在癌旁组织中的表达较弱(图1)，经自动电泳凝胶成像分析
10、系统采集图像，测定条带积分光密度值，以BAMBIGAPDH比值代表BAMBI的相对含量，发现其在癌组织中的表达高于相应癌旁组织，应用配对t检验进行统计分析，两者差异具有显著性意义(表1)。图1，BAMBI mRNA在NSCLC癌及癌旁组织中的表达1：中分化鳞癌；2：中分化腺癌；3，4：低分化腺癌及其癌旁组织；5：高分化鳞癌4表l，BAMBI mRNA在NSCLC癌及癌旁组织中的表达关系二、免疫组织化学染色结果BAMBI蛋白主要表达在胞膜和胞浆，在3175(2063)的癌旁组织中有表达，在6290(3963)的癌组织中表达(Igl25)。两者差异经妒检验具有显著性意义(PO01)(表2)。并且B
11、AMBI在鳞癌中的表达显著低于腺癌(PO05)(表3)。图2，BAMBI在中分化鳞癌中的表达，SP法，x400图3，BAMBI在中分化鳞癌相应癌旁组织中的表达，SP法，x400图4，BAMBI在中分化腺癌中的表达，SP法，x40016图5，BAMBI在中分化腺癌相应癌旁组织中的寝达，sP法，x400袭2，BAMBI蛋白翟ENSCLC镶及癌旁组织中的表达关系17袭3，BAMBI蛋白表达岛NSCLCI临床病理潮豢之间的关系三、细胞系经RTPCR检测结果三椽纲藏静扩增产扬经电泳均呈现片段长发海323bp兹条带(圈6)，与亏|纺设诗片段长发穗持。经鑫钫泡泳凝菠残豫分橱系统采集囤豫，溺定条带积分竞密度值
12、，以BAMBIGAPDH比值代表BAMBI的相对吉量，发现BAMBI在A549中的表达分别低于BEl和LH7，此差异具有显著性意义。J面BEl与LH7之间BAMBI18mRNA表达量经方差分析，差异无显著性意义(表4)。图6，BAMBI mRNA在三株细胞系中的表达表4，BAMBI mRNA在三株细胞系中的表达关系注：p坩LH7：p+wA549：p+4 VSBEl四、Western Blot结果三株细胞的蛋白在29KD处均呈现清晰条带(图7)，与BAMBI的分子量相符。经自动电泳凝胶成像分析系统采集图像，测定条带积分光密度值，以BAMB邶actin比值代表BAMBI蛋白的相对含量，在人肺腺癌细
13、胞系A549及人肺巨细胞癌细胞系BEI、LH7中分别为0769士0103，0963+0061，0957士0048。表达量经统计学处理，A549的BAMBI蛋白表达较BEl和LH7中的BAMBI蛋白表达显著减弱(PO001)，而BEl和LH7之间的BAMBI蛋白表达无差异(p=o096)(表5)。这一结果与BAMBI mRNA在三种细胞中的表达吻合。图7，BAMBI蛋白在三株细胞系中的表达表5，BAMBI蛋自强三抹细胞系中的表达关系注：P+懈LH7；P+A549：P+44坩BEl五、免疫细齄荧竞染色结票三株细胞均里阳性寝达，BAMBI定位在细胞膜以及靠近胞膜的胞浆。麒中BAMBI在A549细胞膜
14、上靛染色强度较弱，且呈现颗粒状不均一栏(图8)；BEl、辩7胞骥豹染色较强，造续且均匀一致。(菡9、10)。这与RT-PCR及Western blot的结果相致。蓬8，免疫荧毙法捡测BAMBI鬣爨在A549爨激系孛茨表达圈9，免疫荧光法梭测BAMBI蛋白在BEl细胞系中的表达图10，免疫荧光法检_；贝BAMBI蛋白在LH7细胞系中的表达讨论BAMBI是人类基因组中瓜蟾BAMBI基因的相似基因，二者在序列+t有较强的霹源性，攀实上，关于人类BAMBI基因的许多功能蓄先是通过对瓜蟓BAMBI基因懿疆究褥翻豹。在爪蟾胚胎中，Onichtchouk等t”发现了结构类似于TGF-p I型爱体的伪受体BA
15、MBI。它可以竞争性地与TGFB II型受体结合，诱导配体T(勰一p超家族成员(TGF8s、BMPs、activins等)形成配体受体复合物。在BMp配体作用下，爪臻殛耱袭这BAMBI，芳豫定逡箨弱手l型或ll滋受薅，簸恧馒之必去与TGF-瑟戆结合能力。由于BAMBI缺麓I型受俸臆内区掰特有的丝氨酸，苏氨黻激酶结构域，而不具备丝氨酸苏氨酸激酶活性，无法磷酸化胞质区的SMAD蛋囱，从而阻断了TGFB信号转导，影响一系列下游基因的表达。另外，BAMBI也可以与I型受体俸嗣形成同静二聚俸，从藤籀铡了受俸复合物瓣形成，使TGF-傣譬应答陷入静止状态。这种掊抗孛#焉宙BMPs诱导，类经予受及馈调节。萁嚣
16、，义窍一些学者糖继在动物试验中检测至IJBAMBI的表达并验证了遮一结果03川。BAMBI因其结构上的特点而广泛参与了TGFB信号的调控，从而在各上皮组织来源的瓣瘤发生中起到熬癸的作用。2e年磐援遥j童s呔ya嚣转应矮受疫缝织纯学、半定量RT-pCR簿方法捡溅窭BAMBI在人结肠癌及肝癌中都有异常高表达，硒在相应的癌旁正常缀织则表达较低。同时，他们不但证明TEBAMBI的启动子上有与BMP相应的结龠位点，因此其转泶受至JBMP的调控，并殿证实BAMBI是B+cateninTCF4信号转姆通路的下游基霆，遴藤攫溅瓣癌豹发生怒囊予p-catenin激瀵BAMBI鲍转录，瓣BAMBI受反馈调节TGF信号，使瓣癌缓藏遂离TTGFp豹缴长捧制作璃。Sasaki等
