《基因敲除技术研究进展》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因敲除技术研究进展（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练文献综述题目：基因敲除技术研究进展作者：王振宇学号：201207744指导教师：谢放完成日期：2014-7-16基因敲除技术研究进展摘要 基因敲除是自 20 世纪 80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。关键词 基因敲除 RNA i 生物模型 基因置换 基因打靶 同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知
2、的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原理
3、，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有 RNA 干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全
4、新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。举一个简单的例子 1：比如有一段序列:1234567890(原基因),敲除后为：“123 7890”,一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如“ABC”,则新的基因为:“123ABC7890” ；或者不插入基因直接连接，则为“1237890” 。基因敲除的细胞基础胚胎干细胞：胚胎干细胞（Embryoonic stem cells，ESC）是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系，体外培养时保持了未分化状态，可以传代增值，在发育上类似于动物早起胚胎的内细胞团细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，
5、是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ESC 是进行基因敲除研究不可替代的材料。目前，虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类型的技术都已相当成熟，对这些类型的细胞进行基因组修饰也是完全可能的，但 ESC 的另一特性是其他任何类型的细胞都不具备的，那就是当将一定数目的 ESC 注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞就可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，在此基础上，通过检测和选配，筛选出基因组中正常基因被破坏的动物个体，通过行为观察、生理生化指标检测等手段可以揭示该基因的作用。迄今为止，只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果最稳定，因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动
6、物模型。2. 实现基因敲除的多种原理和方法：2.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是应用 DNA 同源重组原理发展起来的。80 年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础 2。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年，Thompsson 首次建立了完整的 ES 细胞基因敲除的小鼠模型 6。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1 条件性基因敲除法 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的
7、基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶 Cr e 介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮” ，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。利用 Cr eLox P 和来自酵母的 FLPfrt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的 1oxP，并以此两侧装接上 lox P 的 ES 细胞产生“loxP floxed”小鼠,然后，通过将“lox P floxed”小鼠与 Cr e 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入 Cr e 重组酶)，产生靶基因发生
8、特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“lox P floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个 lox P，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP no xed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cr e 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“lox P floxed”靶基因和Cr e 基因。Cr e 基因表达产生的 Cr e 重组酶就会介导靶基因两侧的 1oxP 间发生切除反应，结果将一个 lox P 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以 Cr e 的表达为前提的。Cr e 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即 Cr e 在哪一种组织细胞中表达
9、，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而 Cr e 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制 Cr e 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。 2.1.2 诱导性基因敲除法 诱导性基因敲除也是以 Cr e/lox p 系统为基础，但却是利用控制 Cr e表达的启动子的活性或所表达的 Cr e 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用 Cr e 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在 1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因
10、敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。诱导性基因敲除优点： .诱导基因突变的时间可人为控制；.可避免因基因突变而致死胎的问题 .在 2 个 lox P 位点之间的重组率较高； .如用病毒或配体 DNA 复合物等基因转移系统来介导 Cr e 的表达，则可省去建立携带 Cr e 的转基因动物的过程。2.2 利用随机插入突变进行基因敲除2.2.1 基因捕获法 基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方
11、法。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是 neo 基因，neo 基因插入到 ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的 ES克隆可以很容易地在含 G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该 100地含有中靶基因 9。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼 cDNA 或染色体组序列分析来获得2.2.2 原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率
12、病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的 T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。2.2.3 基因捕获法的优缺点 用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体以及筛选中靶 ES 细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心 10。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的 ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特
13、异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。 此方法的缺点是只能剔除在 Es 细胞中表达的基因。单种的细胞类型中表达的基因数目约为 I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在 ES 细胞表达的基因，因此，在 ES 细胞中进行基因捕获还是大有可为的。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。2.3 RNA i 引起的基因敲除。2.3.1 基因敲除技术与 RNA 干扰技术（RNA i） RNA i 是近两年才发展起来的一种在 RNA 水平上研究及印尼功能的技术。将化学合成的双链 RNA 分子（ds RAN）或将能表达 ds RNA 的载体
14、转导入体外或动物体的细胞内,ds RNA 会介导受体细胞中序列特异的同源靶 m RNA 发生降解或受阻，引发受体细胞产生转录后水平的基因沉默，使之与相应的内源靶基因表达被阻抑，从而获得类似于基因敲除的基因阻抑效果 12。RNA 干扰为基因和蛋白质学的研究等提供了崭新的技术方法，大有取代基因敲除技术的趋势，但是 RNA 干扰技术存在许多问题，使它不能完全替代基因敲除技术：一、RNA i不适用于所有的细胞，而基因敲除技术则可以作用于个体胚胎发育各个介段，能精确地敲除任何组织或器官的目的基因；二、RNA i 在低等生物中能高效诱发基因沉默，但是在哺乳动物中，RNA i 的抑制效果远远不如在低等生物体
15、中那么明显，而基因敲除对哺乳动物的效果也是明显的；三、基因敲除得到的动物模型具有遗传性，能够进行繁殖而获得大量的基因敲除动物群体，有利于实验的延续，而 RNA i 的基因沉默是没有遗传性的。由于少量的双链 RNA 就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNA i 的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了 RNA i 这种更为简单方便的方法 13。2.3.2 RNA i 阻断基因表达的机理 双链 RNA 进入细胞后，能够在 Dicer 酶的作用下被裂解成 si RNA，而另一方面双链 RNA 还能在 Rd RP（以 RNA 为模板指导 RNA 合成的聚
16、合酶 RNA-directed RNA polym 的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2 是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与 si RNA互补的 m RNA 结合，一方面使 m RNA 被 RNA 酶裂解，另一方面以 Si RNA 作为引物，以 m RNA 为模板，在 Rd RP 作用下合成出 m RNA 的互补链。结果 m RNA 也变成了双链 RNA，它在 Dicer 酶的作用下也被裂解成 si RNA。这些新生成的 si RNA 也具有诱发 RNA i 的作用，通过这个 erase，Rd RP）的作用下自身扩增后，再被 Dicer 酶裂解成 si RNA。Si RNA 聚合酶链式反应，细胞内的 si RNA 大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从 21 到 23 个核苷酸的 si RNA 到几百个核苷酸的双链 RNA 都能诱发 RNA i，但长的双链 RNA 阻断基因表达的效果明显强于短的双链 RN
