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1、微生物的利用专题复习撰稿教师：李文强 责编：陈莉章节概述传统发酵技术的应用和微生物的培养与应用。传统发酵技术的应用要求学生了解传统发酵食品的制作工艺，并掌握发酵食品加工的基本原理和方法，了解食品加工中产生的有害物质的检测方法，并能设计相应的实验装置。微生物的培养与应用介绍了最基本的微生物技术，并通过两个实例帮助学生掌握具体的分离和鉴定方法。本专题的内容在高考中只体现为一个选做题，因此在掌握程度上不应对学生提出太高的要求，但是应当让学生了解基本原理，熟悉基本操作，并能够联系生活进行知识的运用。目标认知学习目标：了解基本原理、获取基本知识、整理分析试验资料，定量表述实验结果重点：微生物的实验室培养
2、；果酒、果醋、泡菜的制作难点：亚硝酸含量的检测知识要点梳理知识网络图：知识链接：果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的原理、实验流程、注意事项；亚硝酸盐含量的检测和鉴定微生物的培养技术微生物的营养；无菌技术；培养基的制备和微生物的纯化技术微生物的培养实例土壤中分解尿素的细菌的分离与计数；分解纤维素的微生物的分离知识结构梳理：影响腐乳品质的条件盐、长满毛霉的豆腐块（毛坯）与盐的质量分数比为 51。盐的浓度过高，影响风味，浓度过低不足以抑制微生物生长，腐乳易腐败变质。装瓶时将毛坯分层摆放在容器中，分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制 8
3、 d。酒的用量：卤汤酒精含量控制在 12左右为宜。酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。发酵的温度：前期发酵温度应保持在 1518 ，毛霉逐渐生长，大约 5 d 后豆腐表面丛生着直立菌丝。发酵时间的长短：酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为1518 ，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约 5 d 后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用
4、，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。香辛料因为具有调味和杀菌也会影响腐乳风味或质量豆腐和腐乳的营养成分大豆是一种富含蛋白质的植物性食物资源，其蛋白质含量达到 3640。经常食用大豆或大豆制品，可有效补充食物中的蛋白质。同时，大豆中含有约 18的脂肪、还含有硫胺素、尼克酸、维生素等多种维生素以及钙、磷、铁等矿物质，对人体具有良好的保健作用。腐乳是一种发酵的大豆食品，
5、豆腐中的蛋白质和脂肪经微生物分解为小分子肽、氨基酸和甘油、脂肪酸等，再经加工腌制成为腐乳，其主要生产过程离不开微生物的发酵。通过发酵使营养物质种类增多，且更易于消化和吸收。亚硝酸盐与癌症亚硝胺类亚硝酸盐是最常用的一种食品添加剂，它能抑制肉毒杆菌的生长，同时保持肉色鲜嫩。它主要用于熟肉食品，如火腿、烤肉、香肠、午餐肉、腊肠、咸牛肉罐头、熏鱼、鱼罐头等，有时在腌制鱼、肉时，也使用硝酸盐作为发色剂和防腐剂。在细菌硝酸还原酶作用下，硝酸盐被还原成亚硝酸盐。亚硝酸盐本身并不致癌，但它与蛋白质代谢后产生的丰富胺类物质结合，形成亚硝胺，后者具有很强的致癌性。硝酸盐可随饮水、进食腌制鱼肉和蔬菜进入人体。硝酸盐
6、除作添加剂使用外，还天然存在于水和某些蔬菜，如菠菜、卷心菜。大白菜中，其含量波动很大，并受栽培方式的影响。过多地使用硝酸盐肥料，尤其在土壤缺钼的地区，都会增加作物和蔬菜中硝酸盐含量。蔬菜中的硝酸盐本身并无害，只是在口腔和胃肠道内被还原成亚硝酸盐，继而与胺类结合成亚硝胺，才产生致癌性。预防亚硝胺致癌应注意以下事项：(1)少吃腌制、熏制肉食及其他亚硝胺或其前体物质丰富的食品尤其是孕妇和儿童，更不宜食用这些食品；(2)腌制的鱼、肉在食用前，应在阳光下曝晒半小时，让阳光中的紫外线把亚硝胺分解掉，或再经过浸泡、冲洗；（3）勤刷牙，保持口腔卫生，减少口腔中因细菌活动可能产生的亚硝胺；（4）维生素 c 具有
7、阻止亚硝胺合成的作用，同时又是一种抗氧化剂，无毒副作用，可根据情况适量补充。培养基的配制原则目的要明确:目的包含两层含义，一指培养的微生物种类、二指培养的目的，是用于生产还是科学研究，因为二者对培养基的化学成分、物理状态等方面要求不同，例如用于生产的培养基应具有原料易得、价格低廉、配制方便等特点，而用于科学研究的培养基应具有成分含量准确，可多次重复实验的特点。营养要协调:它表现在两个方面，一是营养物质的浓度要适宜，二是营养物质间的浓度比例要适宜。pH 要适宜：由于微生物在生长代谢过程中营养物质利用和代谢产物的形成往往会改变环境中的 pH，为了维持培养基中出的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，最
8、常用的缓冲剂是磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。培养基的种类按培养基物理性质划分:名称 特征 功能 固体培养基 外观显固体状态的培养基 主要用于微生物的分离、鉴定 液体培养基 呈液体状态的培养基 主要用于工业生产 按培养基的化学成分划分种类 特征 用途 天然培养基 用化学成分不明确的天然物质配成 主要用于工业生产 合成培养基 用化学成分已知的化学物质配成 主要用于微生物的分类、鉴定 按培养基的功能分种类 制备方法 原理 用途 例 选择培养基 培养基中加入某种化学成分 根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基 使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率 加入青霉素分
9、离得到酵母菌和霉菌 鉴别培养基 加入某种试剂或化学药品 依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计 鉴别和区分菌落相似的微生物 伊红和美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌 微生物的选择培养和鉴别培养（1）筛选菌株微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。在课题 2 提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步
10、的验证。（2）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在 30300 的平板进行计数。教材中 P22 实例是为了说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了 3 个平板，但是，其中 1 个平板的计数结果与另 2 个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将 3 个平板的计数值用来求平均值。这个实
11、例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少 3 个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（3）设置对照教材中 P23 实例是为了说明设置对照组的重要性。A 同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与 A 同学一样的土样进行实验，如果结果与 A 同学一致，则证明 A 无误；如果结果不同，则证明 A 同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将 A 同学配
12、制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。规律方法指导果酒制作具体操作步骤指导：（1）注意选材和材料处理：去除腐烂的籽粒，先用清水冲洗葡萄 12 遍除去污物，后去枝梗，全程防杂菌污染。（2）监控发酵过程：注入发酵瓶的果汁量不要超过塑料瓶总体积的 2/3；发酵旺盛期的 CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子（最好选用塑料瓶），每天要拧松瓶盖 24 次，进行排气。（3）置于适宜的温度下发酵；（4）检测指标：7 10 d 以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可
13、以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检、测定 PH 等工作。果醋制作具体操作步骤指导（1）当糖源不足时，可以用果酒制醋。这种情况下，需要在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至 3035 的条件下发酵，适时向发酵液中充气。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。（2）当糖源充足时，醋酸菌也可以在氧充足的情况下将葡萄糖分解为醋酸，用于制作果醋。 （3）检测指标： 果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的 pH 作进一步的鉴定。此外，还可以通过在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴
14、定。泡菜制作及亚硝酸盐含量的测定操作指导制备的氢氧化铝胶体能吸附泡菜汁液中的杂质，使泡菜汁透明澄清，以便进行后续的显色反应。泡菜腌制及质量检测指标：成功制作泡菜的关键是营造无氧环境。检测指标有乳酸的含量、泡菜的风味品质，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为 0.4%0.8%，风味品质最好，因此，常以这个阶段作为泡菜的成熟期。也可以在显微镜下观察乳酸菌形态，比较不同时期泡菜坛中乳酸菌的含量。并及时对泡菜中亚硝酸盐含量进行鉴定，一般前 14 天呈上升趋势，然后逐渐下降。亚硝酸盐含量的测定：配制的亚硝酸盐标准使用液与样品液显色后，目测比色效果如何，是否与标准液的浓度相吻合。如果不吻合，还
15、应在已知浓度范围内，改变浓度梯度，进一步配制标准使用液。微生物的纯化培养（两种接种方法）平板划线法：操作简单，但是单菌落不易分离无菌操作：在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，
16、以免接种环温度太高，杀死菌种。由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法：操作复杂，但是单菌落易分离无菌操作：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，对涂布器等接种器具进行消毒和灭菌、酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；每一个稀释度下涂布三个平板作为重复组，不同稀释度下涂布的平板形成对照组，且每个平板所用的样液不超过 0.1 毫升。统计实验结果时注意选取菌落数介于 30300 个之间的平板进行计数，且重复组结果要有相近性。评价和分析实验结果培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温 12 d 后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色
