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1、1氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究作者：梁静邓廉夫朱雅萍周琦魏立【摘要 】 目的观察检测低氧和常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因及蛋白表达的改变。 方法采用 35 日龄C57BL/6 小鼠，取四肢关节软骨，经机械分离和酶消化法获得关节软骨细胞，将原代细胞 P0 和传代后细胞 P1、P2 分别在普通和低氧培养箱中培养 2 d，用 RT-PCR 检测 II 型胶原、可聚蛋白聚糖和sox9 特异性基因及 Ihh、PTHrP 、bmp4、wnt5a 分化相关基因的表达差异，原代软骨细胞用免疫组化和阿利新蓝染色检测 II 型胶原、可聚蛋白聚糖的蛋白表达。 结果低氧条件下，免疫组化显示 II
2、型胶原和可聚蛋白聚糖的表达较普通培养增强，II 型胶原、wnt5a 的基因表达增强，Ihh 的表达降低；传代后软骨细胞的蛋白、特异性基因和分化相关基因表达未见明显差异。 结论低氧条件下，原代软骨细胞的 II 型胶原表达增强，且可能主要是受 Ihh、wnt5a 等分化相关基因的调控。短期单层培养方式不能明显改善、 恢复特异性基因表达降低的传代后软骨细胞表型。 【关键词】 软骨细胞低氧型胶原蛋白聚糖Abstract: ObjectiveTo examine the specific gene 2and protein expression of primary and passaged chond
3、rocytes in normal oxygen tension and hypoxia. MethodsArticular chondrocytes were isolated from limb joint cartilage of C57BL/6 mice (35 days). Primary chondrocytes (P0) and passaled chondrocytes (P1, P2) were cultured in normal oxygen tension and hypoxia respectively for two days.The mRNA levels of
4、collagen II, aggrecan, sox9, Indian hedgehog (ihh), parathyroid hormone-related protein (PTHrP), bone morphogenetic protein (BMP)-4 and wnt5a were examined with RT-PCR, and protein levels of collagen II,aggrecan were examined with immunohistochemistry and toluidine blue staining.ResultsDuring the cu
5、lture of primary chondrocyte, the expression of collagen II and aggrecan increased under hypoxia, mRNA levels of collagen II, wnt5a increased and ihh decreased at the same time.The mRNA levels of special genes and differentiation related genes of passaged chondrocytes were not altered under hypoxia.
6、ConclusionProtein and mRNA level of Collagen II of primary chondrocyte under hypoxia increased. It may be regulated by chondrocyte differentiation gene ihh,and wnt5a. The chondrocyte phenotype could not be resumed under hypoxia through short-term monolayer culture in vitro.3Key words：chondrocyte; hy
7、poxia; collagen type II; aggrecan正常生理情况下，关节软骨无直接的血液供应，主要通过关节滑液和软骨下骨组织来间接提供，与其它由动脉血供应的组织相比，关节滑液的氧分压仅约 7%，关节软骨表层的氧分压为 7%，深层则低于 1%，故体内软骨细胞是始终处于低氧环境中的。关节损伤、退变等病理情况时，损伤、炎症等引起关节滑液中氧分压明显降低，导致软骨内氧分压相应下降，影响细胞外基质新陈代谢，将会直接或间接影响关节软骨细胞的正常代谢和功能发挥1 。软骨细胞在体外单层培养时随传代次数增多细胞易发生去分化，细胞呈成纤维细胞样变，II 型胶原及可聚蛋白聚糖表达减少，I 型胶原表达增
8、加2 。为进一步了解低氧对体外培养的软骨细胞表型变化的影响，本实验拟观测低氧与常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因、分化相关基因及蛋白量的改变。1 材料和方法1.1 关节软骨细胞的分离和培养35 d 龄 C57BL/6 小鼠 20 只，断颈法处死，75%酒精浸泡43 min。在超净台上用眼科剪离断四肢，解剖显微镜下清理髋、膝、肩、肘关节周围皮肤、肌肉和软组织，分离出软骨块，放入盛有DMEM（Gibco，USA）培养基的培养皿中。D-Hanks 液冲洗 2 次，将软骨块剪碎，置入锥形瓶中用 5 倍体积的 0.25%胰蛋白酶（Sigma） ， 37 预消化半小时，过滤后将软骨块重新置入锥形瓶
9、用0.2%的胶原酶（ Sigma）继续消化，待大部分软骨块消失，终止消化。过滤获得细胞悬液，1 200 r/min 离心 8 min，去上清，无血清培养基洗涤 2 次，所得细胞沉淀重悬于含 10%胎牛血清（JRH，USA ）的 DMEM 中，按 2.5105/ml 接种于 25 cm2 培养瓶中，以 8105/ml 接种于预置有盖玻片的 24 孔板中，设 3 个复孔，置于 37、5%CO2 饱和湿度的培养箱中培养，即 P0，每 2 d 换 1 次液。1.2 RT-PCR 检测软骨细胞特异基因和分化相关基因的表达1.2.1 细胞标本收集待 5 d 细胞长满后以相同密度接种传代即 P1、P2，并分
10、别将70%80%融合的 P0、P1 、P2 置于普通培养箱和 2%O2（N2 平衡）培养箱（Model 3110，Thermo ）中培养 2 d。用 Trizol 裂解沉淀细胞后，抽提 RNA。51.2.2 RT-PCR 反应取 RNA 2 g，随机引物 1l， 加水至 12 l ，705 min置于冰上；5反应缓冲液 4 l，10 mMdNTP 2 l，RNase 抑制剂 0.5 l，加水至 19 l ，25 5 min；逆转录酶（M-MLV）1 l，42 1 h，7010 min，置于冰上终止反应。按照 945 min-9430 秒，以各基因退火温度 30 秒，7220 秒-72 7 mi
11、n 进行 PCR 反应，各基因引物见表 1。取 10 l PCR 反应产物行琼脂糖凝胶电泳。用天能凝胶图像处理仪紫外灯下观察并拍照。1.3 软骨细胞表型鉴定将不同氧环境下 24 孔板中的玻片取出，进行 II 型胶原和蛋白聚糖（Aggrecan）的免疫组化染色及阿利新蓝染色。1.3.1 II 型胶原和 Aggrecan 的免疫化学染色培养细胞依次执行下列步骤：吸去培养液，PBS 洗 2 次，10 min/次；4% 多聚甲醛室温固定 15 min； 3%H2O2 离子水孵育 10 min，消除内源性过氧化酶活性；牛血清白蛋白封闭 20 min；一抗II 型胶原（ 1100） 、Aggrecan （
12、150）孵育过夜；二抗 37 孵育 1 h；加 ABC3060 min；滴加 DAB 液，镜下观察显色；PBS6缓冲液冲洗，脱水，透明，封片。1.3.2 阿利新蓝染色吸去培养液，PBS 洗 2 次，10 min/次；4% 多聚甲醛室温固定 15 min；PBS 洗 3 次，3 min/次；1%阿利新蓝染色 30 min；蒸馏水冲洗；脱水，透明，封片。2 结果2.1 软骨细胞形态学观察接种后 24 h，倒置显微镜下观察，大部分小圆形细胞已经贴壁。继续培养，典型的软骨细胞为上皮样细胞，外形为多边形或圆形，胞浆丰富，胞核圆形，居中。镜下细胞有立体感。5 d 左右细胞融合，呈明显的铺路石样外观。传代后
13、，细胞由圆形、多边形变成长梭形，并有大量的突起出现。2.2 软骨细胞标志性基因和分化相关基因表达（图 1、表2）RT-PCR 半定量结果：各样本基因表达量各样本目的基因净光密度/各样本 -actin 净光密度（x-s，n3） 。经机械分离和酶7消化方法获得的细胞表达 II 型胶原、Sox9 和 Aggrecan，并且低氧培养时标志性基因的表达高于普通培养。传代后，特异性基因的表达量降低，低氧培养和普通培养未见有明显差异。Ihh 的表达：原代软骨细胞及传代后 P1 低氧培养时低于普通培养，传代后 P2 两种条件下均无 ihh 的表达。Pthrp 的表达：原代和传代后软骨细胞低氧培养时 Pthrp
14、 的表达均低于普通培养，且传代对 Pthrp 的表达没有什么影响。bmp4 的表达：低氧条件下，随着传代，软骨细胞bmp4 的表达逐渐降低，普通培养时 bmp4 的表达基本一致，且原代细胞低氧时 bmp4 表达高于常氧，传代后 P2 低于常氧。bmp7的表达：原代细胞两种条件下 bmp7 的表达没有明显差异，传代后P2 低氧培养时 bmp7 表达明显高于普通培养。wnt5a 的表达：传代后，wnt5a 的表达降低，且两种条件下没有明显差异。原代软骨细胞低氧培养时 wnt5a 的表达高于普通培养。表 1 RT-PCR 反应各基因引物序列及反应条件目的基因引物序列产物大小（略）2.3 细胞免疫化学
15、染色和阿利新蓝染色（图 2）低氧和普通培养时原代软骨细胞均有大量免疫化学染色阳性的棕褐色细胞和阿利新蓝染色阳性细胞，低氧时软骨细胞着色多深于普通培养。传代后，细胞形态由圆形、多边形变为长梭形，且胞体变大，突起增多，II 型胶原和 Aggrecan 染色着色变淡，两种条件培8养没有明显差异。2.4 统计分析RT-PCR 半定量结果用均数标准差（x-s）表示，采用SPSS 11.5 软件进行分析，用非配对 t 检验， P0.05 有统计学意义。3 讨论关节软骨急性损伤、慢性劳损及年龄增长引起的退变等病理情况下，由于软骨自身修复能力差，一旦损伤即产生永久性病变。随着组织工程学的发展，关节软骨损伤的修
16、复技术也取得了长足进展。种子细胞-软骨细胞的来源及体外的扩增培养是组织工程学修复软骨的重要环节。软骨组织较之其他血供丰富的组织器官，其组织内氧分压更低。在关节软骨组织不同区带，氧分压存在着差异，介于1%7%之间。软骨细胞处于低氧环境，通过糖酵解获取能量。低氧是软骨细胞生长和存活的一个关键因素。低氧可促进软骨细胞分化和软骨基质合成，但抑制软骨细胞的最终分化，并且低氧能明显促进间充质细胞向软骨细胞方向分化，促进软骨基质合成，在细胞培养和器官培养中均抑制最终分化3 。所以适宜的氧环境也是体外软骨细胞生存的重要条件。表 2 常氧和低氧条件下关节软骨细胞9P0、 P1、P2 各基因 mRNA 表达的 RT-PCR 半定量结果（略）软骨细胞为维持软骨的特性会分泌特异的蛋白。II 型胶原是关节软骨内表达最多的胶原蛋白，它与其他胶原相互交织形成纤维网，使软骨组织具有张力和剪力特性，并
