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1、1氧化苦参碱对小鼠局灶性脑梗死的保护作用【摘要】 目的 观察氧化苦参碱(OMT)对小鼠局灶性脑梗死 (CI)的保护作用。方法 健康成年雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组以及 OMT 预处理组。用线栓法制作小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。假手术组及模型组术前 30 min 腹腔注射 0.9%生理盐水 4 ml，OMT 组腹腔注射 OMT 35 mg/kg。记录小鼠清醒后神经功能缺损程度，TTC 染色测定梗死体积，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 活性，TBA 法测定 MDA 含量，TUNEL 法测定细胞凋亡。结果 与模型组相比，OMT 组小鼠术后 24 h 神经功能缺损评分下降，梗死体积缩小，SOD
2、活性升高，MDA 含量减少，神经元凋亡减轻。结论 OMT 可能通过提高 SOD 活性起到对小鼠局灶性 CI 的保护作用。 【关键词】 脑梗死;氧化苦参碱;保护作用氧化苦参碱(OMT)具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫调节等多方面的药理作用1，2 ，一直用于病毒性肝炎及免疫调节方面的治疗，但在脑血管疾病方面尚无尝试。本实验制作小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，观察 OMT 对脑梗死(CI)小鼠神经功能缺损、梗死体积、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及神经元凋亡的影响，探讨 OMT 对 CI 是否具有保护作用及可能机制。21 材料与方法1.1 实验动物与分组 健康成年雄性昆明小鼠 45
3、 只，体重3540 g，长春医学高等专科学校动物中心提供，随机分为假手术组、模型组及 OMT 预处理组，每组 15 只。1.2 主要仪器及试剂 恒冷箱冷冻切片机 (Leica，德国) ，倒置荧光显微镜(Nikon，日本)，紫外分光光度计(CE2041，北京)。主要试剂：SOD、MDA 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;一步法 TUNEL 凋亡检测试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所提供。1.3 模型制作及给药方法 小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型制作参考文献3 。小鼠以 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，常规备皮、消毒后颈部正中切口，分离暴露右侧颈总动脉及颈内外动脉，结扎颈
4、总动脉近心端及颈外动脉起始部，颈总动脉靠近分叉处套线备用，动脉夹暂时夹闭颈内动脉。在距离颈总动脉分叉处 2 mm 左右处剪一小口，插入单股尼龙线( 长 3 cm，直径0.104 mm，于 1、2、3 处分离标记)约 11 mm，有轻微阻力时停止，扎紧缝线，剪掉多余线栓，缝合并再次消毒皮肤。假手术组除不插线外，其余步骤相同。术中用白炽灯加温维持小鼠肛温约 37。OMT 为陕西慧科植物开发有限公司，纯度 98%，生产批号SF20061215，临用时以蒸馏水制成混悬液。OMT 预处理组在手术3前 30 min 腹腔注射 OMT 35 mg/kg。各组小鼠均在手术后 24 h处死。1.4 观察指标 (
5、1)神经功能缺损评分：清醒后对小鼠神经功能缺损进行评分4 。 0 级为无神经功能缺失症状 ;1 级为左前爪不能完全伸展;2 级为轻轻向后牵拉鼠尾并将后肢提起，左前爪抓力明显减低;3 级为运动自如，但牵拉鼠尾时会向左侧倾斜或转圈 ;4 级为向左侧倾斜或划圈运动;5 级为刺激后运动;6 级为刺激无运动，伴有意识障碍;7 级为死亡;07 分别为 07 分。选取 15 分小鼠进行相应指标检测，每组 15 只。(2)红四氮唑(TTC)染色测定梗死体积：3 组大鼠中每组各取 5 只，手术后 24 h 快速断头取脑，-20冷冻20 min 后行 1 mm 厚冠状切片，立即置于 1%TTC 溶液中 37 恒温
6、避光孵育 30 min，正常脑组织为红色，梗死为白色。染色的切片经扫描后接入电脑。用 ImagePro 软件进行图像分析，计算梗死体积百分比。(3)SOD 活性以及 MDA 含量测定：每组小鼠各取 5只快速断头取脑，冰盘中分离出右侧额顶部脑组织，滤纸吸干水分，称重后制成 10%组织匀浆， 4 3 500 r/min 离心 10 min 后取上清液，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，按照试剂盒说明书操作。(4)TUNEL 法测定细胞凋亡：每组小鼠各取 5 只，术后 24 h 经麻醉后迅速开胸，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，先用 0.1 mol/L 预冷 PBS 100 ml 灌注至清澈，
7、再用预冷 4%多聚甲醛灌注 150 ml。断头取脑， 37 4%多聚甲醛后固定 4 h，流水漂洗4过夜，5%、10%、15% 、20%、25%、30% 梯度蔗糖脱水直至沉底，用冰冻切片机做连续冠状切片，片厚 6 m。切片经室温晾干，用含有 1% Triton X 100 的 PBS 洗涤 35 min，按照 TUNEL 检测试剂盒说明书配制检测液，在样品上加 50 l 检测液，37 避光孵育 60 min，孵育至 45 min 时加入 DAPI 复染。PBS 避光洗涤 38 min，油封片后在荧光显微镜下观察染色阳性的细胞。每组 5 张切片，每张切片取 5 个互不重叠的视野计算染色阳性的细胞百
8、分比。正常细胞核为蓝色，凋亡的细胞胞核为黄绿色。1.5 统计学处理 计量资料以 xs 表示，采用单因素方差分析。2 结 果2.1 各组小鼠神经功能缺损评分比较 假手术组小鼠未见神经功能缺损症状(0 分);模型组神经功能缺损较为明显(4.910.52)分 ，OMT 预处理组神经症状明显减轻(2.580.37) 分(P0.05)。2.2 各组梗死体积比较 假手术组未见病灶(0)，模型组以及OMT 预处理组梗死灶主要位于右侧颞、顶叶皮质以及基底节区。其中模型组平均梗死体积百分比(50.783.96)%较 OMT 预处理组(30.822.97)%明显增高(P0.05)。52.3 各组 SOD 活性以及
9、 MDA 含量比较 模型组 SOD 活性(55.325.69)U/mg较假手术组(70.824.78)U/mg明显减低(P0.05)，OMT 预处理组 SOD 活性(61.233.24)U/mg明显高于模型组(P0.05)。模型组 MDA 含量(15.684.57)nmol/mg较假手术组(6.482.37)nmol/mg 明显增高(P0.05);而 OMT 预处理组 MDA 含量(7.382.56)nmol/mg则明显低于模型组(P0.05)。2.4 各组细胞凋亡比较 假手术组仅见少量凋亡细胞，凋亡率为(1.420.13)%;模型组凋亡细胞明显增多，凋亡率为(55.673.57)%，远远高于
10、假手术组(P0.05)。经 OMT 预处理后凋亡细胞虽然高于假手术组，凋亡率为(35.193.24)%，但仍远远低于模型组(P0.05)。3 讨 论本研究采用线栓法制作小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，更符合临床常见的 CI 发病过程。模型制作成功后梗死部位大多位于右侧颞顶叶皮质以及基底节区。脑组织富含磷脂，梗死后组织缺血，大量的自由基形成，引起生物膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，造成生物膜结构和功能破坏5 。因此有效清除自由基是减轻脑缺血损伤的靶点之一。SOD 能催化 O2 发生歧化作用，是清除6细胞内自由基，保护细胞免受氧化应激损伤的关键酶之一。脂质过氧化产物 MDA 含量可以高度反映神经
11、元的毒性效应，作为主要的自由基清除剂，SOD 的含量升高可阻止过氧化反应引起的组织损伤。在本实验中脑组织血液循环中断后 24 h 小鼠出现大面积脑梗死，SOD 活性下降，MDA 含量升高，大量神经元凋亡。给予OMT 预处理后，可提高 SOD 活性，降低 MDA 含量，从而使凋亡神经元数量减少，梗死体积缩小，发挥保护神经元的功能。以上结果提示 OMT 可使神经元对自由基的清除能力加强，抗脂质过氧化能力提高，提示升高 SOD 活性可能是其减轻脑组织缺血损伤的机制之一。【参考文献】1 Lu LG，Zeng MD,Mao YM,et al.Oxymatrine therapy for chronic
12、hepatitis B：a randomized double blind and placebocontrolled multicenter trialJ. World J Gastrgenterol，2003;9(11) ：24803.2 Zheng P，Niu FL，Liu WZ,et al.Antiinflammatory mechanism of oxymatrine in dextran sulfate sodiuminduced colitis of ratsJ.World J Gastroenterol，2005;11 (31)：749125.3 席刚明，汪华侨，魏国耀，等. 小鼠颈动脉系解剖与测量在局灶性脑缺血模型中的应用J.解剖学研究，2004;26(3)：1713.4 Xi GM，Wang HQ，He GH,et al.Evaluation of murine models of permanent focal cerebral ischemiaJ.Chinese Medical Journal，2004;117(3)：393403.5 吴 江. 神经病学M. 北京：人民卫生出版社，2005：15092.
