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1、第二节菌种来源Chapter 2 continued微生物工程工业生产水平的三个决定要素 : 生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节 .一、菌种分离与筛选工作程序发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。分离与筛选菌种的具体做法一般分 4个步骤：样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定调查研究（包括资料查阅）试验方案设计采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离增殖条件探索根据实际情况进行定量或半定量测定第一次原种斜面第二次原种斜面初筛 （1 株 1瓶）定量或半定量测定筛选工作程序第三次平板分离第三次
2、原种斜面复筛第四次平板分离不纯第四次原种斜面再复筛种子培养初步工艺条件摸索较优菌株1株 3-5瓶保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏二、分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料2、菌的生长温度3、菌的稳定性4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株三、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（ 丰富、 5-25cm、土质、酸
3、碱度、植被状况、地理条件、季节）食品 、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 ；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样四、含微生物样品的富集培养富集 (enrichment)培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有
4、利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制 pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等五、目的菌种的分离与筛选分离的效率取决于培养基养分、 pH值和加入的选择性抑制剂。分
5、离与筛选常用的方法是利用固体平板的生化反应进行分离 。其分离要点有二：利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 涂布法将菌液梯度稀释后以灭菌的涂布器涂布于平板培养基表面。（易污染菌落，且一种菌/ 平板） 影印平板法把长有许多菌落的母培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的圆木柱上，然后把这一 “印章 ”上的细菌一次接种到一系列选择培养基平板上。（不适用不长孢子的链霉菌和游动细菌）通常有两种方法：不管是哪种方法，都有其优缺点；故要根据自己的实验目的设计一种更为有效的分离筛选新菌种的方法。可显著提高分离筛选效率的方法有：
6、透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法1、透明圈法h 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；h 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；h 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；3、生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度指示菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈指示菌（工具菌）是一
7、些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌4、抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法指示菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈定义：应用微生物遗传和变异理论，用人工方法 (或自然变异的方法 )造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。菌种选育的目的是： a.为了不断提高发酵工业产品的产量和质量； b.增
8、强对所用原辅料的适应性；c. 增强对不良培养条件的抵抗； d.缩短生产周期；e. 简化发酵和下游处理工艺。菌种选育的方向是选育 “吃粗粮 ”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。第三节菌种选育自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种一、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自发突变 (spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下 降对生产有益的：
9、生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的 最大缺点 是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。二、诱变育种) 诱变育种 就是利用物理或化学诱变剂等处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究。)诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。) 目前发酵工业中应用的生产菌株
10、大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例， 1943年开始生产时的效价仅为 20U/ml，通过多次诱变育种现已达 50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。 理论基础是基因突变。诱变育种的原理染色体畸变：基因突变：（点突变）缺失、异位、倒位、重复碱基对置换、突变一）诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备活细胞计数诱变剂处理活细胞计数中间培养突变株分离初筛复筛生产性能试验诱变预备处理诱变育种的工作程序1、出发菌株的选择 出发菌株的来源：自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株。具备一定的生产形状，对环境有
11、好的适应性，正突变大。已经历多次育种处理的菌株。损伤较大，负突变大选择第 1或2类菌株，第 2类较佳。2、单细胞（或单孢子）悬液制备一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂2）可避免长出不纯的菌落。处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态细胞菌龄一般在对数期，霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。表型迟延现象：指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落的现象。（如多核）生理性延迟现象：菌体虽然发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍然不表现突变形状。如营养缺陷型3、诱变剂
12、及诱变处理凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称 诱变剂 。如 紫外线 、 X-射线、 -射线、 -射线、快中子、激光、超声波、 离子束等硫酸二乙酯 (DES)、亚硝基胍 (NTG)、亚硝酸 (NA)、氮芥 (NM)、羟胺、吖啶类物质、 2-氨基嘌呤等诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂噬菌体、转座子诱变处理确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。通常在诱变处理之前，做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，从而选择合适的处理剂量。 对一般微生物而言，突变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。 处理高剂量致死率 90-99.9%；低
13、剂量到 70-80%；更低剂量 30%-70%凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。单一诱变剂处理复合处理1）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用处理方法菌种 单独处理诱变剂突变率（% ）复合处理诱变剂突变率（% ）土曲霉 紫外线X-射线21.319.7紫外线 +X-射线 42.8土曲霉 氮芥（0.1% ）紫外线不明显4.7氮芥+ 紫外线 11.0链霉菌 紫外线-射线31.035.0紫外线 +-射线 43.6金色链霉菌 二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5二乙烯三胺+ 紫外线硫酸二乙酯+ 紫外线26.635.9诱变
14、剂的复合处理及其协同效应5、变异菌株的筛选由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。初筛和复筛在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。初筛要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。复筛在初筛缩小了的范围中选出产量最高的 1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。复筛一般是将初
15、筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。第一轮：1个出发菌株诱变处理200个单细胞菌株50 株 5 株初筛每株 1瓶复筛每株 4瓶第二轮：5个出发菌株诱变处理40株40株40株40株40株50 株 5 株初筛每株 1瓶复筛每株 4瓶三、杂交育种（hybridization）定义： 一般指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、 F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传形状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。了解概念，其他内容不作考试内容四、原生质体融合育种原生质体融合（protoplast fusion）： 是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又称为“ 细胞融合 ” （cell fusion）了解概念，其他内容不作考试内容第四节菌种退化和菌种保藏一、菌种退化通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。1. 菌种退化主要表现 : 形态上： 分生孢子的减少或菌落颜色的改变 生理上： 生产量下降或抗噬菌体能力减弱2. 引起菌种退化的原因： 基因突变 ：主要原因（负突变） 连续传代 ：直接原因菌种退化二、防止
