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1、1断血流皂苷 A 的药动学研究作者：陈娇婷，张道英，王跃生【摘要 】 目的研究断血流皂苷 A 在大鼠体内的药动学。方法建立柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷 A 浓度的方法。色谱条件：预处理柱(PC)：大连装 Kromasil C18（20 mm4 mm，5 m） ；预处理流动相：甲醇- 水；预处理流动相流速：1.0 mlmin-1；分析柱 (AC)：Lichrospher 100 RP-18e(250 mm4 mm，5 m)；分析流动相：甲醇-0.01 molml-1 磷酸盐缓冲液( 磷酸调 pH =3.0)（6040） ；分析流动相流速：0.6 mlmin-1；分析柱柱温：45；检测
2、波长：250 nm。健康大鼠禁食 24 h 后，尾静脉注射断血流皂苷 A 溶液，测定不同时间的血药浓度。用 3P87 药动学程序对血药浓度一时间数据进行拟合。结果大鼠在尾静脉注射断血流皂苷 A 后，其主要药动学参数为：Vt(0.310.05)Lkg-1，CL(1.130.32)mlmin-1 ，Ke(0.900.18)h-1，t1/2(0.760.11)h，曲线下面积 AUC(24.984.82)( gh) ml-1。结论断血流皂苷 A 在大鼠体内呈一室开放模型，进入体内迅速分布，代谢消除也较快。 【关键词】 断血流皂苷 A； 柱切换 高效液相色谱法； 药动学2断血流皂苷 A(clinopod
3、iside A)系从断血流中提取的主要成分, 属于齐墩果烷型三萜皂苷类，含量较高，且化学性质稳定，断血流为 20 世纪 70 年代从民间验方筛选，经临床验证后被国家药典录入的少数几个单味药之一，其疗效确切，安全性高，被公认为中医临床首选口服妇科止血药。临床上断血流制剂被广泛用于治疗各种出血、单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等症1 。近年来，有关断血流的研究主要集中于有效成分的提取、鉴别、药理、药效及临床应用。而断血流药动学研究未见报道。为此，本文参照相关文献28 ，建立了柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷A 浓度的方法，对大鼠静注断血流皂苷 A 后的药动学进行了研究，为其新剂型的研究和
4、临床合理用药提供依据。1 仪器、试药与动物Agilent 公司 1100 系列高效液相色谱仪(包括 DAD 检测器)；FCV-2A 高压切换阀；高速离心机(上海安宁科学仪器司)；BSZ-2 型自动双重水蒸馏系统(上海博通) ；SartoriusBP221S 型电子天平(美国 Sartorius 公司)；TG328B 型析天平( 万分之一天平)( 上海天平仪器厂)。断血流皂苷 A 对照品（中国药品生物制品检定所） ，甲醇为色谱纯，水为三重蒸馏水（自制） ，其余试剂为分析纯。3健康 SD 雄性大鼠 (江西中医学院动物中心 )，雄性，体质量(199.74.3) g，实验前大鼠禁食 12 h，可自由饮
5、水。2 方法2.1 色谱条件预处理柱(简称 PC)：大连装 Kromasil C18（20 mm4 mm，5 m） ；预处理流动相(简称 PMP)：甲醇-水；预处理流动相流速：1.0 mlmin-1；分析柱(简称 AC)：Lichrospher 100 RP-18e(250 mm4 mm，5 m)；分析流动相（简称 AMP）：甲醇-0.01 molml-1 磷酸盐缓冲液(磷酸调 pH =3.0)（6040） ；分析流动相流速：0.6 mlmin-1；分析柱柱温：45；检测波长：250 nm。2.2 对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的断血流皂苷 A对照品 7.5 mg，置 25 ml 量瓶中，
6、用分析流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得含断血流皂苷 A 为 0.3 mgml-1 的对照品溶液。2.3 样品处理步骤取大鼠血浆样品 1.0 ml，置 2 ml 具塞离心试管中，加 0.3 molL-1 的三氯乙酸 0.2 ml，离心(4 000 rmin-1，10 min)，精密量取上清液置于试管中，氮气吹干，残渣用 15%甲醇溶液转入 1 ml 量瓶中，加 15%甲醇至刻度，摇匀，滤过，作4为供试品溶液。2.4 柱切换系统及操作本实验应用自装定时装置，控制切换阀自动切换。该装置可预置 T1(样品预处理时间)和 T2(AC 与 PC 串联时间)。样品进样的同时启动该装置，首先使切换阀处于
7、PC 与AC 并联的 A(预处理)状态，经 T1(2 min)时间的预处理后切换阀自动切换至 PC 与 AC 串联的 B 状态，使保留在 PC 上的样品组分被AMP 洗脱至 AC 上，经 T2(2 min)时间后，即自动切回初始 A 状态；待下次进样时再次启动该装置重复操作。2.5 专属性实验取空白大鼠血浆按样品处理步骤方法操作，其色谱图见图 1(A)；空白大鼠血浆加断血流皂苷 A 对照品的色谱图见图 1(B)；大鼠静脉注射给药断血流皂苷 A 后的血浆色谱图见图1(C)。由图 1 可知，在本色谱条件下，断血流皂苷 A 能够检测到，并且与血浆中的内源性物质分离良好。断血流皂苷 A 的保留时间约为
8、 7 min。2.6 标准曲线 取空白大鼠血清 1 ml，加入上述对照品溶液0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 ，1.5 ml，置于 10 ml 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得到浓度为0.015，0.021，0.027，0.033，0.039 ，0.045 mgml-1 的系列对照品溶液。按照“2.3” 项下样品处理步骤制备成对照品溶液，在拟定色谱条件下精密吸取 10 l 注入液相色谱仪，记录峰面积。以进5样量(X，g) 对峰面积进行线性回归，得方程为：Y=0.311 3X-0.044 1（r=0.999 5）结果表明断血流皂苷 A 在 1545 gml-1范围内具有良好的线性关系。2.7
9、日内和日间精密度 取一定量（高、中、低 3 种浓度）断血流皂苷 A 对照品大鼠血浆液，按“2.3”项下样品处理步骤处理，采用断血流皂苷 A 血浆柱切换高效液相色谱法测定，在 1 天内连续测定 6 次，得日内精密度分别为 1.22， 0.81和 0.39(n=6) ；连续 3 d 测定，测得各浓度的日间精密度 RSD 分别为：1.67、0.74和 0.45(n=6) 。2.8 重复性实验取断血流皂苷 A 对照品大鼠血浆液，按“2.3”项下样品处理步骤处理制备 6 份对照品溶液，采用断血流皂苷 A 血浆柱切换高效液相色谱法测定，得 RSD 为 2.1（n=6） ，表明本方法重复性良好。2.9 样品
10、稳定性实验取一定量（高、中、低 3 种浓度）断血流皂苷 A 对照品大鼠血浆样品，分别进行样品处理液稳定性实验：进样条件下样品处理液在 5 放置 0，4，10 ，20，40 h 进样分析；样品冷冻放置稳定性试验：20冷冻储藏，分别放置0，6 ，20 ，40 d 后按 “2.3”项下样品处理步骤处理进样分析；室温放置稳定性试验：室温放置 0，1 ，2，4 h 后按“2.3” 项下样品6处理步骤处理进样分析。所用测定结果准确度均在 89%112%范围内，RSD 均5，断血流皂苷 A 在上述条件下均稳定性良好。2.10 净化回收率取一定量（高、中、低 3 种浓度）断血流皂苷 A 对照品血浆液，按前述色
11、谱条件测定含量 5 次，另取相同进样量断血流皂苷 A 对照品溶液，直接进样测定。按峰面积计算，得血浆净化回收率。结果见表 1。表 1 净化回收率（略）2.11 方法回收率于空白大鼠血浆中加入一定量（高、中、低3 种浓度）断血流皂苷 A 对照溶液，按“2.3”项下样品处理步骤处理，按前述色谱条件测定含量 5 次，求出回收量浓度（即实测值）与加入量浓度之比，即为断血流皂苷 A 血浆空白加样回收率。结果见表 2。表 2 方法回收率（略）2.12 药动学研究方法随机取大鼠 6 只。按 10 mgkg-1 尾静脉注射断血流皂苷 A，给药后 5，10，20，50，90 ，150，240 min 时分别从眼
12、眶取血，肝素抗凝，按 “2.3”步骤分离血浆，并于-20保存。采用柱切换高效液相色谱法测定断血流皂苷 A 的血药浓度，大鼠 iv 给药后的平均药物浓度一时间曲线见图 2。将不同时间断血流皂苷 A 的血药浓度用 3P87 软件处理，表明大鼠在尾静脉注射断7血流皂苷 A 后，其血药浓度随时间变化符合一室开放模型，主要药动学参数为：Vt(0.310.05)Lkg-1，CL(1.130.32) mlmin-1，Ke(0.900.18)h-1，t1/2(0.760.11)h,曲线下面积AUC(24.984.82)( gh) ml-1。3 讨论本实验首次建立了生物样品中断血流皂苷 A 的 HPLC 测定法
13、，断血流皂苷 A 与血及各组织中的其他成分完全分离，测定结果不易被干扰，方法回收率较高，精密度良好。本法操作简便、成本低廉，适用于断血流皂苷 A 的药动学研究。断血流皂苷 A 在大鼠体内呈一室开放模型，进入体内迅速分布，代谢消除也比较快，其生物半衰期为 46 min。【参考文献】1Lee JH，Kim JM，Kim CPharmacokinetic analysis of rhein in rheum undulatum LJ.J Ethnopharmacol，2003，84(1)：5.2潘丽怡，车庆明，何红. 灯盏花乙素的药动学研究J.中国药学杂志，2006，41(9)：689.83葛庆华，
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15、graphy eleetrospray ionization mass spectronmetryJ .J ChromatogrB，2004，809：285.8Pei WJ，Zhao XF，Zhu ZM，et alStudy of the determinati0n and pharmacokinetics of compound Danshen Dripping pills in human plasma by column switching liquid chromatography electrospray inn trap mass 9spectrometryJ .J Chromatogr B，2004809：237.
