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1、1放射性核素骨显像动态检测组织工程化骨血管化的价值【摘要】 目的放射性核素骨显像动态检测评价组织工程化骨血管化与骨代谢的价值。 方法取大白兔 24 只，抽取骨髓，行骨髓间充质干细胞分离、培养与骨向诱导。双侧股骨髁制作 0.6 cm1.2 cm 的骨缺损，将诱导后的骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石复合植入左侧骨缺损处为实验组，右侧单纯植入珊瑚羟基磷灰石为对照组。术后 4、8、12 周分别行静态放射性核素骨显像检测，用ROI 计数计算不同时间点的 ROI 平均计数。 结果结果术后4、8 、12 周实验组 ROI 计数(单位像素) 均较对照组有显著性增高。实验组 ROI 计数随时间的延长，呈明显的上
2、升趋势，术后 8 周开始增长放缓；对照组 ROI 计数术后 8 周增长缓慢，8 周后开始增长加快，两组均在 12 周达到峰值。 结论骨髓间充质干细胞诱导后与珊瑚羟基磷灰石复合可有效的修复股骨髁松质骨缺损。放射性核素骨显像可动态检测组织工程化骨血管化及骨代谢变化。 【关键词】 放射性核素骨显像; 血管化; 骨髓间充质干细胞; 骨缺损; 珊瑚羟基磷灰石Abstract：ObjectiveTo dynamically monitor revascularization and metabolism of tissueengineered bone 2graft in repairing bone d
3、efects by radionuclide bone imaging.MethodTwentyfour healthy New Zealand rabbits were studied. Mesenchymal stem cells(MSCs) were separated and cultured from bone marrow.Cancellous bone defects(0.6 cm1.2 cm) were created on bilateral femoral condyles in rabbits. The compound of coral hydroxyapatite c
4、eramic(CHA) and defects were treated with the induced osteoblasts inplanted into the left defects (experimental group). While CHA alone was used for the right (control group). The counts of regions of interest( ROI) was evaluated by radionuclide bone imaging at 4,8 and 12 weeks postoperatively.Resul
5、tROI in the experimental group was significantly higher than that of control group at 4,8 and 12 weeks postoperatively. ROI in either group had a tendency to increase with time. Eight weeks postoperatively, ROI in experimental group tended to increase at a lower speed, while ROI in control group had
6、 a tendency to increase at a higher speed. ROI in either group reached a peak at 12 weeks postoperatively.ConclusionThe tissueengineered bone graft is an effective method for repairing cancellous bone defects. Radionuclide bone imaging can dynamically monitor the changes of revascularization and met
7、abolism of 3tissueengineered bone graft.Key words：mesenchymal stem cells; revascularization; mesenchymal stem cell; bone defect; tissueengineered bone随着组织工程学的迅速发展，应用种子细胞复合生物材料修复骨缺损已有较多的报告。但组织工程化骨血管化及骨代谢应用 X 线、组织学技术来评价缺乏定量分析。本研究以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)为种子细胞骨向诱导后与珊瑚羟基磷灰石复合修复兔股骨髁松质骨缺损，应用
8、放射性核素骨显像来评价组织工程化骨血管化与骨代谢的动态变化。1 材料与方法1.1 材料取 57 个月龄健康清洁级新西兰大白兔(济南军区总医院动物中心，编号：SCKX 204057)24 只，体重 2.52.9 kg，雌雄不限。珊瑚羟基磷灰石为颗粒状 5P10R（直径 1 4 mm） ，孔径大小400 500 m，空隙率 30%70%，由北京意华健科贸有限公司提供。41.2 方法1.2.1 骨髓 MSCs 的分离、培养与骨向诱导 无菌条件下于兔股骨大转子下穿刺，抽取骨髓约 5 ml 后缓慢注入含 10 ml 淋巴细胞分离液的离心管中；2 500 r/min 离心 15 min,吸取界面层细胞,
9、将细胞悬液按 4105/mL 接种于 75 ml 培养瓶内,按贴壁培养法分离骨髓 MSCs。取第 4 代骨髓 MSCs 将基础培养液更换为成骨诱导培养液（地塞米松 10-8mol/L +甘油磷酸钠 10 mmol/L +维生素 C 50 mg/L， pH7.30） 。置 37、 5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。每 3 d 换 1 次液。诱导后于 28 d 分别行茜素红染色、 ALP 测定、I型胶原组化染色鉴定成骨细胞。1.2.2 体外组织工程化骨的构建 取同种异体第 3 代骨髓 MSCs，细胞密度调整到 4106/ml，加入成骨诱导培养液盖过材料，放置37、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，次日
10、改换成骨诱导培养液，继续孵育 4 d。1.2.3 松质骨缺损模型的建立与修复 速眠新耳静脉麻醉后，无菌条件下取兔左侧股骨远端外侧切口，显露股骨外髁，切去骨膜。用直径 0.6 cm 环锯在股骨髁由外髁向内髁制作一 0.61.2 cm 的松质骨穿通性骨缺损，植入体外构建的组织工程化骨为实验组。同法制作右侧股骨髁骨缺损，仅植入珊瑚羟基磷灰石为对照组。51.2.4 放射性核素骨显像 术后 4、8 、12 周分别取动物 8 只，根据体质量（18.5 mBq/kg）耳缘静脉注射 99mTcMDP,3 h 后, 速眠新耳缘静脉麻醉，固定四肢,应用低能高分辨探头距离双侧股骨髁10 cm,以 0.2 桢/min
11、 采集一幅静态图象。以双侧股骨缺损处 1 cm2 cm 大小的矩形为兴趣区(regionsof interest,ROI),用 ROI 计数( 单位像素 )计算不同时间点的 ROI平均计数。1.2.5 统计学分析 使用 SPSS 12.0 软件统计处理，计量资料以s 表示， 组之间采用配对 t 检验，组内采用方差分析及 q 检验。2 结 果2.1 一般观察术后动物均未出现切口红肿、渗血渗液等情况，术后 1 周恢复正常活动。2.2 核素骨显像结果术后 12 周静态核素骨显像结果见图 1，由图 1 可见左侧股骨髁6同位素较右侧浓聚。术后实验组与对照组不同时间点 ROI 值平均计数结果见表 1。术后
12、 4、8、12 周实验组 ROI 平均计数均较对照组高，有显著性差异(P0.01)。 表 1 实验组和对照组不同时间点 ROI 值平均计数注：1.与对照组相比，a P0.012.术后不同时间点之间比较，b P0.05由图 2 可见，实验组与对照组 ROI 平均计数随着时间的延长呈明显的上升趋势，组内比较有显著性差异（P0.05） ；但实验组术后 8 周内 ROI 平均计数上升斜率大，术后 8 周开始上升放缓，术后12 周达到峰值；而对照组术后 8 周内 ROI 平均计数上升斜率小，术后 8 周始上升斜率加大，在 12 周达到观察期内峰值，但仍低于实验组。图 1 术后 12 周放射性核素骨显像示
13、左侧股骨髁同位素较右侧浓聚图 2 不同时间点 ROI 平均计数曲线图3 讨 论骨组织工程包括三大要素：种子细胞、生物材料及生物活性因子。7骨髓 MSCs 是骨组织工程中常用的种子细胞，经分离、诱导后与生物材料复合构建组织工程化骨，移植体内后依靠种子细胞的成骨作用及生物材料的降解吸收，最终形成新生骨组织。本研究应用同种异体骨髓 MSCs 与 CHA 复合修复股骨髁松质骨缺损，术后各个时间点实验组 ROI 计数均明显高于对照组，表明组织工程化骨移植后新骨生成与代谢活跃，血供丰富。放射性核素成像的基本原理是根据人体骨骼中含有羟基磷灰石等无机盐胶原纤维等有机物的特点，以静脉或口服途径将亲骨性放射性核素
14、及其化合物摄人体内，通过血液循环，与骨中羟基磷灰石结晶体表面上不同的价数正负离子进行离子交换和化学吸附，或与骨中未成熟的胶原结合而进入骨组织并显像。骨骼摄取骨显像剂的影响因素有：(1)局部骨组织血液供应系统的完善和骨内血液的流动率1 ；(2)骨代谢活性，首要因素是骨的更新速率；(3)与类骨质和未成熟胶原对 99mTcMDP 的亲和力及碱性磷酸酶的促进作用有关2 。99mTcMDP 是常用的放射性核素，静脉注射后 4 h 后，约有 12 通过吸附方式与晶体表面结合沉积在骨骼内，余者由肾脏迅速排出体外 。因此骨显像中放射性核素的分布不仅能显示骨骼的形态，而且可以间接反映局部骨的血流灌注量、骨矿物质
15、代谢、骨的更新速率和成骨活动情况；血供丰富，成骨活跃，骨显像上表现为放射性浓聚，反之则表现为放射性稀疏或缺损。Smeele 等报道放射性核素骨显像检测的准确性可达 1003 。8本研究实验组和对照组随时间变化两组 ROI 计数都有上升趋势，但实验前 8 周 ROI 计数增幅迅速，812 周增幅趋缓，结合组织学变化分析，表明移植物血管化、骨代谢活性前 8 周为快速发展阶段，812 周已进入缓慢发展渐趋成熟阶段。对照组术后 8 周 ROI 计数上升缓慢，8 周后增幅迅速， 12 周均达峰值，与其它学者的报告结果4，5一致。本研究组织工程化骨组与对照组 ROI 计数的峰值时间点与文献报告5相符，而与
16、吴雪晖等 6报告的峰值时间分别为 4、8 周不同，这可能与生物材料的不同或和修复的骨缺损部位不同有关。本研究应用同种异体兔 MSCs 植入修复松质骨骨缺损，术后放射性核素骨显像示骨代谢与新骨生成活跃，并未影响移植骨的修复能力，与窦强兵等7应用同种异体 MSCs 复合纤维蛋白修复骨缺损的组织学结果一致。但对同种异体 MSCs 的免疫反应及其对骨修复的影响，尚有待于进一步的探讨。【参考文献】 1 Holmberg S, Thorngren KG. Preoperative 99mTcMDP scintimetry of femoral neck fracturesJ . Acta Orthop Scand, 1984, 4:430-435.92 Moyi S,Hongeai D,Tiangiu M, et al. Radionuclide observation
