《截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、 多克隆抗体的制备和鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、 多克隆抗体的制备和鉴定（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、 多克隆抗体的制备和鉴定【摘要】 目的: 构建截短型鸭乙型肝炎病毒（DHBV）核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达, 制备多克隆抗体。方法: 应用基因工程技术将编码截短型 DHBV 核心蛋白 (DHBcAg 1214aa) 的基因片段装入原核表达载体 pRSETB 内, 在宿主菌 Rosetta(DE3) pLacI 内进行诱导表达, 运用 NiNTA 方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫 BALB/c 小鼠制备多克隆抗体 , 并采用酶联免疫吸附实验(ELISA), Western blot 及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果: 成功地构建了
2、含截短型 DHBV 核心区基因的质粒, 并纯化得到了相对分子质量(Mr)约为 28 000 的目的蛋白 , 用之免疫 BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论: 获得的重组截短型DHBV 核心抗原纯度高, 免疫反应性强; 获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性, 为 DHBV 的检测和研究奠定了实验基础。 【关键词】 鸭乙型肝炎病毒 核心蛋白 原核表达载体 多克隆抗体鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝 DNA 病毒科, 被广泛用于研究嗜肝 DNA 病毒的复制机制、 细胞表面病毒受体、 病毒清除机制和筛选新
3、的抗病2毒药物的动物模型。DHBV 主要编码外膜蛋白、 核心蛋白和 P 蛋白, 其中核心蛋白(DHBcAg)分子约 262 个氨基酸,其氨基端有装配核心颗粒, 羧基端有结合核酸的功能 1。最近研究中, Thermet 等2通过对 DHBcAg 和 HBcAg 抗原决定区（AR）的比对, 得出DHBcAgAR5 与 HBcAgAR2 相似的结论, 并结合文献报道HBcAg 按其功能的不同大致可分为装配区(1 144aa) 和核酸结合区(145183/185aa)3。本研究中我们将 DHBcAg 从 AR5 后的214 位氨基酸截取, 构建截短型 DHBV 核心蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达
4、, 制备多克隆抗体。1 材料和方法1.1 材料 限制性内切酶 Xho I、 Pst I、 T4 DNA 连接酶、 LA Taq酶、 蛋白 marker、 DL 2000 购自 TaKaRa 公司。NiNTA Spin Column kit 购自德国 Qiagen 公司。鼠抗 His 单克隆抗体（mAb）和 HRP 标记羊抗鼠 IgG 为美国 Santa Cruz 公司产品。GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder 购自立陶宛 MBI 公司。异丙基D 硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国 Promega 公司。Western blot 试剂盒购自 Pierce 公司。DYY5 型双稳定
5、时电泳仪、 DYCZ24D 型迷双垂直电泳槽及 DYCZ40D 型迷转移槽均购自北3京六一仪器厂。生物素标记羊抗鼠 IgG 免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。氢氧化铝佐剂购自武汉生物制品研究所。引物合成及序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。重组表达质粒 PCR2.1DHBV1.54, 含 T7 启动子的原核表达载体pRSETB, 宿主菌 E.coli DH5、 表达菌 E.coli Rosetta(DE3) pLacI 由本室保存。68 周龄雌性 BALB/c 小鼠, 由同济医学院实验动物中心提供。1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建及鉴定根据 GenBank 提供的序列（
6、DQ276978）分别设计上游引物 CP1(26502668nt) 5CCGCTCGAGGGATATCAATGCTTCTA3, 引入酶切位点 Xho I(框中部分, 下同); 下游引物 CP2(250267nt) 5TACACTGCAGCAGGTTCAAGTCCACGAGG3, 引入酶切位点Pst I。以全长 PCR2.1DHBV1.5 质粒为模板, PCR 扩增DHBcAg1214 氨基酸的编码序列, 反应的条件为: 94 10 min预变性, 随后 94 45 s, 50 45 s, 72 50 s, 共 30 个循环, 最后72延伸 10 min。扩增相应片段后回收纯化 PCR 产物用
7、Xho I 和Pst I 进行酶切 , 然后与同样双酶切的原核表达载体 pRSETB 回收4纯化后, 用 T4 DNA 连接酶 16连接 12 h, 连接产物转化 DH5菌后挑取克隆, 用 PCR 和酶切法鉴定正确后进行测序分析, 该重组质粒命名 pRSETBDHBc214。此载体在目的片段的 N 端有 6 个His, 以便于表达后的鉴定与纯化。1.2.2 重组质粒的诱导表达取重组质粒 pRSETBDHBc214 转化到 E.coli Rosetta(DE3) pLacI, 涂板, 挑克隆, 经 PCR 筛选及酶切鉴定正确后将含有重组质粒的 E.coli Rosetta(DE3) pLacI
8、接种于 1 mL SOB 培养液内(含 100 g/L 氨苄青霉素 35 g/L 氯霉素) , 37摇菌 12 h左右, 以 150 比例接种到 10 mL SOB 培养液内 , 37 摇菌 46 h至 A600=0.40.6 时加入 IPTG 至终浓度为 2 mol/L, 37 250 r/min 诱导 16 h。同时取空载体进行同样的转化、 诱导。SDSPAGE 电泳分析 5 h 蛋白表达量最大。1.2.3 目的蛋白的纯化(NiNTA 法)按方法 1.2.2, 诱导表达 250 mL 菌液, 10000 r/min(JA25.50 转头) 4离心 10 min, 沉淀按 5 mL/g 湿质
9、量混悬于预冷的新鲜裂解缓冲液中, 再按 1 g/L 加入溶菌酶, 冰浴 30 min5后超声破菌。溶解物 4 10000 g 离心 20 min, 收集上清及沉淀。将沉淀用 NiNTA Spin Column 纯化, 操作方法依照 NiNTA Spin Column kit 说明进行。纯化蛋白-70保存。1.2.4 目的蛋白的浓度及纯度检测用 Bradford 检测法测定目的蛋白浓度。将目的蛋白表达过程中的各个组分进行 SDSPAGE 电泳, 结果进行蛋白条带灰度扫描 , 并用 Quantity One 4.6 软件进行纯度分析。1.2.5 目的蛋白 Western blot 检测空菌及空载体
10、和重组质粒转化菌变性后经 SDSPAGE 分离, 将凝胶置转移缓冲液中平衡 20 min, 再 100 mA 稳流 2 h 转印蛋白到硝酸纤维素膜上, PBST 漂洗后用 100 mL/L FBS/PBST 4封闭过夜。再用 PBST 漂洗后用 50 mL/L FBS/PBST 稀释的第一抗体（11000 稀释的鼠抗 His mAb）, 37震荡孵育 1 h, PBST 漂洗 3次, 加入 50 mL/L FBS/PBST 稀释的第二抗体（ 12000 稀释的HRP 标记的羊抗鼠 IgG）, 37震荡孵育 45 min, PBST 漂洗 3 次, 取等量的 ECL 发光剂 A 液和 B 液混匀
11、后孵育硝酸纤维素膜 , 压片曝光。61.2.6 动物免疫将纯化得到的目的蛋白 200 g 溶于 500 L PBS 中, 再与等体积氢氧化铝佐剂混合, 按 40 g/只的抗原剂量, 分别免疫 5 只BALB/c 小鼠, 皮内多点注射。第 14 天和第 28 天各加强免疫 1次, 加强免疫的方法和抗原剂量同上。第 35 天摘小鼠眼球取血, 静置离心后分离血清, 分别检测 5 只小鼠血清效价。1.2.7 抗体滴度检测将 NiNTA 法纯化所得的目的蛋白按每孔 100 L（0.25 mg/L）包被酶联免疫吸附（ELISA ）板, 4 孵育过夜, PBST 洗 3次, 50 mL/L FBS/PBST
12、 37封闭 2 h 后加入不同稀释度的免疫小鼠血清, 37孵育 1 h, PBST 洗 5 次, 加入 HRP 标记的羊抗鼠IgG 37孵育 45 min, PBST 洗 5 次以四甲基联苯胺（ TMB）过氧化氢系统为底物 37显色 5 min 中止, 酶标仪 450 nm 检测。以正常小鼠血清作为阴性对照。1.2.8 多克隆抗体特异性检测(1)Western blot 检测, 方法同前, 纯化蛋白每孔上样量为 15 g, 第一抗体为多克隆抗体血清（11000）和鼠抗 His 7mAb(11000), 第二抗体为 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（12000） 。以正常小鼠血清作对照。 （2）选用
13、鸭肝炎组织进行免疫组织化学检测, 多克隆抗体血清稀释度为 18000, 采用化学发光法显色。2 结果2.1 目的基因的获得和重组质粒的构建及鉴定 PCR 产物经12 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离 , 在 640 bp 左右可见特异性扩增条带。重组质粒 pRSETBDHBc214 经 Xho I 和 Pst I 双酶切后分别得到约 2900 bp 和 642 bp 的片段, 与预期大小一致(图 1)。重组质粒测序结果同模板比较核苷酸序列同源性为 100%。2.2 目的蛋白表达及纯化从 SDSPAGE 电泳发现目的蛋白诱导表达 5 h 后获得量最大而空菌诱导相同时间未见目的条带（图 2） 。超速离心
14、后发现目的蛋白主要在沉淀中, 以包涵体的形式存在。经过 NiNTA 纯化发现大部分的目的蛋白位于洗脱液中而且获得到的目的蛋白纯度达到 95 %（图 3） 。2.3 目的蛋白 Western blot 的检测8用鼠抗 His mAb 为第一抗体, 发现在 Mr 28000 处, 空菌和空载体菌均无条带, 重组未诱导菌仅有微弱条带, 诱导菌有较强的条带, 提示经过诱导后获得了截短型的 DHBc1214 目的蛋白（图 4） 。2.4 多克隆抗体效价检测纯化的重组蛋白（0.25 mg/L）每孔 100 L 包被, ELISA 法分别检测 5 只小鼠的抗体效价 , 最高可达 120000。2.5 多克隆
15、抗体的特异性检测Western blot 检测发现, 抗 DHBc1214 多克隆抗体（11000）和鼠抗 His 抗体为第一抗体在 Mr 28 000 处有明显的特异性条带, 而正常小鼠血清在该处无条带（图 5） 。免疫组织化学检测, 发现鸭肝炎组织有明显的阳性显色, 抗原分布主要为胞质型和胞膜型（图 6） 。3 讨论 已知 HBV 核心蛋白 N 端的 1144 位氨基酸是颗粒装配区3 , 能在多种系统中表达并形成正常的球形结构5。而对于 DHBV, 虽然认为其氨基端有装配核心颗粒, 羧基端有结合核酸的功能, 但装配9区和核酸结合区具体分界位点还不清楚。近年来, 通过对 DHBV 核心蛋白
16、3D 模型的建立及功能区了解的加深2, 我们通过分析将DHBV 核心蛋白 N 端的 1214 氨基酸截取, 保留了 DHBcAg 的主要抗原决定区, 去除了与其免疫功能作用不大的 C 末端, 通过在大肠杆菌中的原核表达获得重组截短型鸭乙型肝炎病毒核心抗原（DHBcAg 1214 氨基酸）, 并免疫 BALB/c 小鼠制备出多克隆抗体。该多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性, 可用于鸭乙型肝炎病毒 ELISA、 Western blot 和免疫组化等的检测筛选, 为进一步研究鸭乙型肝炎病毒核心蛋白的结构与功能奠定了实验基础, 也为鸭乙肝动物模型的应用提供了有用的工具。另外, 通过与 HBV、 HEV 和 WHV 截短型核心蛋白的比较6, 7, 由于
